Liczba bakterii w wodzie z akwarium rafowego: wartości podstawowe i modulacja poprzez dozowanie węgla, odpienianie białka i filtrację granulowanego węgla aktywnego

24 Luty 2022

Liczba bakterii w wodzie z akwarium rafowego: wartości podstawowe i modulacja poprzez dozowanie węgla, odpienianie białka i filtrację granulowanego węgla aktywnego

Wydziały Chemii (Ken S. Feldman, Allison A. Place) oraz Inżynierii Przemysłowej i Produkcji (Sanjay Joshi), Uniwersytet Stanowy Pensylwanii, University Park, Pennsylvania 16802 oraz Route 66 Marine, Gardena, Kalifornia (Gary White)

1. Wstęp

Bakterie są wszechobecne w środowisku morskim i odgrywają absolutnie decydującą rolę w każdej możliwej do wyobrażenia niszy ekologicznej. Liczne badania udokumentowały wpływ działania bakterii na procesy życiowe i transdukcję energii w naturalnych rafach, jak wyszczególniono poniżej. Brakuje jednak odpowiedniego napływu informacji na temat biologii bakterii w naszych akwariach morskich w niewoli . Na przykład nierozerwalny związek między całkowitym węglem organicznym(TOC) w naturalnym środowisku morskim i jednym z jego głównych konsumentów, bakterioplanktonie, stanowi najbardziej podstawowy poziom morskiej sieci pokarmowej (Johannes, 1967; Ducklow, 1979; Eppley, 1980; Ducklow, 1983; Gottfried, 1983; Moriarity, 1985). Tak więc wypasanie się bakterii na tym bogatym w węgiel źródle pokarmu jest absolutnie obowiązkowym pierwszym krokiem na drodze do włączenia tego centralnego składnika odżywczego do łańcucha pokarmowego. Oprócz źródła węgla bakterie potrzebują w znacznych ilościach związków azotu i fosforu oraz śladowych ilości wielu innych pierwiastków , z których być może najbardziej krytycznym jest żelazo. Niedobory któregokolwiek z tych makro- lub mikroelementów mogą w zasadzie służyć jako ogranicznik wzrostu (szczegóły poniżej).

Z drugiej strony, znacznie mniej wiadomo na temat zapotrzebowania na składniki odżywcze bakterii w zamkniętym środowisku akwarium rafowego i w rzeczywistości nie przeprowadzono żadnych badań, które dokumentowałyby reakcje wzrostu bakterii na jakikolwiek konkretny składnik odżywczy w zbiorniku rafowym. Niemniej jednak, jedna z nowszych metodologii eksportu składników odżywczych akwariów opiera się na hipotezie, że wzrost bakterii w akwariach rafowych jest ograniczony do węgla. Metodologia ta została nazwana „Dozowaniem węgla” (Walton, 2008; Michael, 2008) i ma trzy podstawowe założenia:

Wzrost bakterii w akwariach rafowych jest ograniczony źródłem węgla.
Dodanie strawnego źródła węgla pobudzi zatem wzrost populacji bakterii, a wraz z tym wzrostem inne niezbędne składniki odżywcze, takie jak związki zawierające azot i fosfor, zostaną usunięte z kolumny wody .
Filtracja mechaniczna poprzez odpienianie białek (i ewentualnie granulowany węgiel aktywny (GAC)) usunie bakterie z kolumny wody w akwarium, a wraz z nimi ich ładunek składników odżywczych C/N/P.

Tak więc, zgodnie z tym podejściem, eksport niepożądanych składników odżywczych (związków azotu i fosforu) zostanie osiągnięty dzięki dozowaniu węgla. Promowano dużą różnorodność źródeł węgla, w tym wódkę (EtOH), sacharozę (cukier stołowy), ocet (kwas octowy) i stałe biopeletki (biodegradowalne poliestry). Ponadto do tej nowej technologii włączono media, które rzekomo ułatwiają tworzenie biofilmu bakteryjnego, takie jak zeolity. Oczywiście eksport bakterii przez szumowanie wymaga, aby bakterie faktycznie znajdowały się w słupie wody, a nie jako film na stałym podłożu, dlatego też w procesie tym wbudowano mechanizmy mechaniczne do usuwania biofilmów z tych mediów, takie jak mieszanie (zeolityczne) media często. Wreszcie, Kilku komercyjnych zwolenników tej metodologii oferuje pakowane mieszanki bakteryjne i pokarmy bakteryjne jako zestawy startowe. Jednak pomimo prozelityzmu jego zwolenników, to podejście do eksportu składników odżywczych opiera się całkowicie na nieprzetestowanych hipotezach, które wymieniono powyżej. Czy to naprawdę działa zgodnie z reklamą?

Nasze wcześniejsze badania na temat poziomów składników odżywczych węgla w akwariach morskich (Feldman, 2008; Feldman, 2009; Feldman, 2010) dostarczyły dokumentacji eksperymentalnej dla czterech wniosków, które mają wpływ na zarządzanie OWO w naszych zbiornikach rafowych:

Akwaria rafowe wykorzystujące aktywną filtrację (GAC, szumowanie) utrzymują równowagę TOC w zakresie występującym na zdrowych rafach tropikalnych.
Odpienianie białka (tj. bąbelki) nie jest zbyt skuteczne w usuwaniu TOC z wody akwariowej, zubożając typową wodę w akwarium rafowym tylko o ~ 20 – 35% obecnego TOC po karmieniu.
Filtracja GAC jest dość skuteczna w usuwaniu zawartości OWO z wody w zbiorniku rafowym, usuwając 60 – 85% obecnego OWO.
I, co dość intrygujące, naturalna filtracja biologiczna, która zaczyna się od bakterii i innych drobnoustrojów, jest niezwykła pod względem zdolności do remediacji wody w zbiorniku rafowym z TOC, łatwo usuwając 50% lub więcej wzrostu TOC w wodzie po karmieniu.

Wnioski (2) i (3) opisują konsekwencje filtracji mechanicznej na poziomy TOC, ale czwarty wniosek podkreśla znaczenie „ukrytej” części równania remediacji, drapieżnictwa bakteryjnego, dla zrozumienia dynamiki handlu węglem w nasze akwaria. W rzeczywistości ta obserwacja, w połączeniu z pojawieniem się strategii dozowania węgla w eksporcie składników odżywczych, doprowadziła do nowej serii pytań dotyczących być może kluczowej roli bakterii, a przynajmniej bakterii znajdujących się w słupie wody, w udanej hodowli akwariów rafowych.

1.1 Cel naszego badania – testowanie słuszności hipotezy o dozowaniu węgla

Mając te informacje jako preambułę, postanowiliśmy zbadać następujące pytania:

Jakie są populacje bakterii w słupie wody zbiorników rafowych i jak ta wartość ma się do liczby bakterii w autentycznej wodzie rafowej?
Czy dozowanie węgla rzeczywiście zwiększa populację bakterii w słupie wody (tj. czy wzrost węgla jest ograniczony)?
Czy filtracja mechaniczna (odpienianie białek i/lub filtracja GAC) faktycznie usuwa bakterie z słupa wody, a jeśli tak, to w jakim stopniu?

1.2 Bakterie: ogólne wprowadzenie

Bakterie znajdują się wszędzie na powierzchni Ziemi, gdzie woda jest przynajmniej tymczasowo dostępna. Ich wszechobecność, wraz z samą ich liczbą i szybkim tempem wzrostu, oznacza, że są niezwykle ważnymi czynnikami geochemicznymi. Ułatwiając wodne procesy utleniania-redukcji, koncentrując metalkationy i aniony, tworząc zmagazynowaną energię chemiczną, rozkładając materiał organiczny oraz pośrednicząc w wytrącaniu i rozpuszczaniu minerałów, napędzają cykle biogeochemiczne Ziemi. Podobnie bakterie są niezbędnymi czynnikami w procesach biogeochemicznych zachodzących w akwariach morskich. Te procesy biogeochemiczne obejmują rozkład materii organicznej, nitryfikację, denitryfikację, asymilację składników odżywczych i pierwiastków, sekwestrację i uwalnianie („cykling”) oraz chelatację i tworzenie kompleksów z szeroką gamą jonów i związków.

Jeszcze w połowie lat sześćdziesiątych społeczność naukowa nie była całkowicie przekonana, że „bakterie morskie” istnieją jako odrębna grupa. Okazało się, że bakterie morskie mają specjalne wymagania dotyczące jonów nieorganicznych, aby zaspokoić ich potrzeby do wzrostu i metabolizmu, a także do utrzymania integralności swoich komórek. Mają bardzo specyficzne zapotrzebowanie na sód, zapotrzebowanie na wyższe stężenia potasu, wapnia i magnezu niż są zwykle dostępne w środowiskach słodkowodnych lub lądowych i wykazują tolerancję na jony halogenkowe, której brakuje wielu innym grupom bakterii. Wiele szczepów bakterii morskich preferuje aminokwasy jako źródło węgla, azotu i energii oraz wymaga witamin i innych czynników wzrostu (MacLeod 1965). Wynika to z różnic w składzie ściany komórkowej, wymagań jonowych,

Fizjologia bakterii

Bakterie to najbardziej zróżnicowana fizjologicznie grupa organizmów w akwarium morskim. Są jednokomórkowe (nie różnicują się w formy wielokomórkowe) prokariotyczne (nie mają błony jądrowej, a ich DNA nie jest zorganizowane w chromosomy) i rozmnażają się przez podział komórki. Typowa komórka bakteryjna ma średnicę lub szerokość około 1 mikrometra (uM), w porównaniu z większością komórek eukariotycznych, które różnią się średnicą od 10 do 100 uM. Bakterie mają trzy ogólne kształty: pręciki („bacilli”), kule („cocci”) i spiralne („spirilla” lub „vibrio”). Kiedy poszczególne komórki rosną jeden po drugim, tworzą tak zwane włókna. Posiadają pięć charakterystycznych elementów strukturalnych: niezwiązany DNA („nukleoid”), rybosomy („fabryki” wytwarzające białka), błonę komórkową, ścianę komórkową, oraz warstwę powierzchniową, która może, ale nie musi być nieodłączną częścią ściany komórkowej. Struktury te są ułożone w trzy regiony architektoniczne: (1) region cytoplazmatyczny, który zazwyczaj zawiera ponad 70% wody i jest zbliżony do neutralnego pH. Region ten zawiera materiał genetyczny komórki, rybosomy, wakuole gazowe, które nadają komórce pływalność oraz różne „wtrącenia” i granulki, które służą jako specyficzne miejsca przechowywania. Rozpuszczalna część („cytosol”) zawiera różne małe cząsteczki organiczne irozpuszczony nieorganicznyjony; (2) usztywniająca ściana komórkowa na wierzchu błony komórkowej, która zapewnia wsparcie dla komórki, ochronę przed zewnętrznymi stresami fizycznymi i reguluje kształt komórki („morfogeneza”). Region ten działa również jako filtr, kontrolując przejście rozpuszczonych cząsteczek do komórki. Ściana komórkowa może również wykazywać przyczepione wyrostki, w tym wici (włókniste struktury białkowe generujące ruch w ruchliwych szczepach) oraz fimbrie i pigułki (białka podobne do włosów, które wykazują szeroką różnorodność form i rozmieszczenia, zaangażowane w przyczepianie się komórek do powierzchni , substraty i inne komórki); oraz (3) warstwę powierzchniową. Trzy główne typy warstw powierzchniowych to polimery zewnątrzkomórkowe („kapsułki”), osłony i warstwy S. Funkcje tego regionu obejmują (a) ochronę przed ekstremalnymi warunkami środowiskowymi i pH, (b) przywiązanie i

Bakteryjny ładunek powierzchniowy i szumowanie białka

Odchodzące od ściany komórkowej i regiony warstwy powierzchniowej są organicznymi „grupami funkcyjnymi”. Grupy funkcyjne to specyficzne zbiory atomów połączone razem w dobrze zdefiniowane struktury; struktury te zazwyczaj nadają zbiorowi atomów jeden odrębny wzór reaktywności chemicznej. Wiele z tych organicznych grup funkcyjnych może albo wiązać jony wodorowe („protonowanie”), albo uwalniać jony wodorowe („deprotonacja”), w zależności od pH bezpośredniego otoczenia komórki bakteryjnej. Połączone stany protonowania i deprotonacji grup funkcyjnych na ścianie komórkowej w dużej mierze determinują hydrofobowe i hydrofilowe właściwości komórki bakteryjnej przy dowolnym pH. Grupy funkcyjne mogą również działać jako ligandy, które mogą wiązać się z innymi jonami lub związkami, tworząc większe kompleksy cząsteczkowe. Na przykład, oszacowano, że aż 99% żelaza rozpuszczonego w wodach powierzchniowych oceanów wiąże się z ligandami organicznymi (Granger, 1999). Takie kompleksy mogą również nadawać ładunek ścianie komórkowej, wpływając w ten sposób na właściwości hydrofobowo-hydrofilowe komórki. Grupy funkcyjne mogą być wyspecjalizowane do działania jako czynniki chelatujące do wychwytywania i transportu określonych jonów („syderofory”). Powstały kompleks może również wpływać na ładunek powierzchniowy.

Ładunek powierzchniowy komórki bakteryjnej wpływa na jej hydrofobowe/hydrofilowe właściwości, a tym samym na zdolność tej komórki do usunięcia z roztworu przez frakcjonowanie piany („szumowanie białek”). Usuwanie cząstek, takich jak bakterie, a także rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) na bazie bąbelków, w dużej mierze zależy od hydrofobowego charakteru cząstki/cząsteczki; im bardziej hydrofobowe łaty, tym większa energia wiązania z powierzchnią bańki, a zatem większe prawdopodobieństwo usunięcia na podstawie baniek (Feldman, 2010 i cytowane tam odnośniki). Wykazano, że dodanie soli nieorganicznych do roztworu zawierającego bakterie zwiększa szybkość usuwania komórek bakteryjnych z tego roztworu (Gaudin, 1960 i 1962). Wykazano, że chlorek magnezu i chlorek wapnia zwiększają stężenie komórek bakteryjnych w piance generowanej przez szumowanie białek (Bretz, 1966). Różnice między typami grup funkcyjnych obecnych na ścianach komórek bakteryjnych, ładunkiem na powierzchni komórki bakteryjnej, odpowiedzią na pH otoczenia i stężeniem soli nieorganicznych wpływają na stopień, w jakim komórka bakteryjna jest dostępna do eksportu poprzez szumowanie białek. Wpływ ten występuje niezależnie od fizycznych właściwości eksploatacyjnych danego a stężenie soli nieorganicznych wpływa na stopień, w jakim komórka bakteryjna jest dostępna do eksportu poprzez szumowanie białek. Wpływ ten występuje niezależnie od fizycznych właściwości eksploatacyjnych danego a stężenie soli nieorganicznych wpływa na stopień, w jakim komórka bakteryjna jest dostępna do eksportu poprzez szumowanie białek. Wpływ ten występuje niezależnie od fizycznych właściwości eksploatacyjnych danegoodpieniacz białka .

1.3 Procesy życiowe bakterii

Metabolizm bakteryjny

Metabolizm bakteryjny opisuje zestaw procesów chemicznych, które umożliwiają bakteriom wzrost, rozmnażanie, utrzymywanie struktur i interakcję z otoczeniem. Fizyczne i genetyczne cechy bakterii mają ogromny wpływ na ich metabolizm. Niewielki rozmiar bakterii pozwala im pozyskiwać energię zewnętrzną i składniki odżywcze na obrzeżach komórki oraz optymalizować procesy transportu do/z komórki. Te procesy transportu obejmują dyfuzję bierną i ułatwioną, transport aktywny i pochłanianie materiałów błoną komórkową (endocytoza). Bakterie syntetyzują białka, aby regulować każdą fazę ich zachowania metabolicznego. Rodzaje białek, które bakteria może syntetyzować, zależą od jej cech genetycznych.

Wzrost bakterii

Populacje bakterii w akwariach morskich mogą zakończyć swój cykl życiowy całkowicie jako izolowane lub częściowo izolowane szczepy w słupie wody systemu („wolno żyjące”) lub przyczepione do powierzchni w kolonii składającej się z wielu szczepów („biofilmy” lub „ maty”). Populacje bakterii wykazują cykl wzrostu z czterema etapami: (1) faza „opóźnienia”, która jest początkowym okresem czasu, w którym komórki dostosowują się do nowego otoczenia i syntetyzują białka w odpowiedzi na to środowisko; (2) faza „wykładniczego wzrostu”, podczas której populacja wykazuje szybki wzrost biomasy; (3) faza „stacjonarna”, podczas której nie ma wzrostu lub spadku ogólnej liczby komórek, a grupy w populacji mogą być albo aktywne metabolicznie, albo nieaktywne; (4) faza „śmierci”, podczas której zmniejsza się liczba żywotnych komórek. Gdy populacja wchodzi w fazę śmierci, jej członkowie mogą kompensować to poprzez pączkowanie i tworzenie struktur ochronnych, takich jak egzospory, endospory i cysty. Takie struktury ochronne okazały się niezwykle udaną adaptacją ewolucyjną; na przykład,Zarodniki Bacillus zostały wskrzeszone po przechowywaniu w bursztynie przez 25 milionów lat (Cano, 1995). Czynniki charakterystyczne dla środowiska bakterii mogą również regulować wzorce wzrostu bakterii. Czynniki te obejmują dostępność składników odżywczych, temperaturę, podaż substratu, drapieżnictwo i śmiertelność wirusów.

Bakteryjne składniki odżywcze

Bakterie morskie wykorzystują ogromną grupę pierwiastków i związków, aby zaspokoić swoje zapotrzebowanie na energię i składniki odżywcze. Bakterie morskie mają szczególne zapotrzebowanie na sód. Inne ważne pierwiastki wymagane do wzrostu i rozmnażania bakterii morskich to węgiel, azot, fosfor, tlen, wodór, siarka, potas, magnez, wapń i żelazo. Typowe wymagania dotyczące pierwiastków śladowych obejmują mangan, kobalt, cynk, miedź i molibden. Grupy chemiczne zaspokajające potrzeby energetyczne i odżywcze obejmują jeszcze szerszy zakres; nieorganiczne związki węgla, organiczne związki węgla (ogólnie, ale nie wyłącznie, cukry i aminokwasy), nieorganiczne i organiczne związki azotu, organiczne związki siarki, nieorganiczne związki fosforanów oraz sole potasu, magnezu, wapnia i żelaza. Bakterie morskie potrafią sekwestrować pierwiastki takie jak potas, w ich komórkach w stężeniach znacznie przekraczających stężenie pierwiastka w ich środowisku (Thompson i MacLeod, 1974). Taka sekwestracja stwarza możliwość pewnego stopnia wyczerpania pierwiastków w akwarium morskim poprzez eksport bakterii poprzez szumowanie białek.

Manipulowanie wzrostem bakterii

„Ograniczający składnik odżywczy” to składnik odżywczy, który pomimo swojej obecności lub braku ma zdolność ograniczania wykorzystania innych składników odżywczych. Tempo wzrostu bakterii, produkcja węgla bakteryjnego i wydajność wzrostu bakterii zwiększają się wraz z dodatkiem organicznych suplementów węgla w pewnych grupach bakterii morskich (Carlson, 1996). Wykazano, że obecność łatwo przyswajalnego źródła węgla zwiększa pobieranie amonu przez niektóre grupy bakterii morskich (Goldman, 2000). Dostępność poszczególnych składników odżywczych może wpływać nie tylko na tempo wzrostu populacji bakterii, ale także na jej funkcjonowanie metaboliczne. Wykazano, że dostępność węgla organicznego nie tylko ogranicza tempo wzrostu bakterii denitryfikacyjnych, ale także ogranicza tempo, w jakim zachodzi denitryfikacja (Brettar, 1992). Substancje chemiczne inne niż węgiel organiczny, takie jak fosforan nieorganiczny, również mogą działać jako ograniczające składniki odżywcze (Rivkin, 1997). Rzeczywiście, biorąc pod uwagę szybkie i dynamiczne zmiany w zachowaniu metabolicznym bakterii morskich w czasie w odpowiedzi na zmieniającą się dostępność składników odżywczych, opisywanie bakterii morskich jako ograniczanych przez jeden składnik odżywczy może być niewłaściwe.

Częstotliwość, z jaką uzupełniane są składniki odżywcze, może wywierać znaczący wpływ na populacje bakterii. Wykazano, że reżimy żywieniowe o różnej okresowości prowadzą do mieszanych heterotroficznych społeczności bakteryjnych o odmiennych właściwościach fizjologicznych. Zaobserwowano również, że wzajemne oddziaływanie między różnymi szczepami bakterii i innymi uczestnikami społeczności drobnoustrojów może być równie ważne jak selektywne siły środowiska w kształtowaniu społeczności drobnoustrojów. Być może najbardziej interesujące jest to, że gdy replikowane kultury bakteryjne poddano identycznej suplementacji składników odżywczych, funkcjonalność społeczności drobnoustrojów została zachowana pomimo faktu, że składy społeczności były znacząco różne (Carrero-Colon, 2006). Zatem,

Koralowy Holobiont

Holobiont koralowca składa się z bliskich powiązań między samym zwierzęciem koralowym, jego symbiotycznymi zooxantellami i różnorodnymi powiązanymi drobnoustrojami, w tym bakteriami, archeonami, glonami i grzybami. Te asocjacje mogą mieć miejsce w bezpośrednim otoczeniu koralowca, na jego powierzchni, w jego tkankach i w jego szkielecie (jeśli jest obecny). Ten paradygmat podkreśla potencjalny wkład każdego składnika w ogólną funkcję i zdrowie koralowców (Rypien, 2010). Dynamiczny charakter tych zależności można zaobserwować w porównaniu świeżo zebranych koralowców z regionu Morza Czerwonego , które następnie umieszczono w akwariach morskich. Udokumentowano przesunięcie społeczności drobnoustrojów w bakteriach zasiedlających powierzchniową warstwę śluzuzebrane koralowce po umieszczeniu w akwarium morskim w niewoli . Różnice, które pojawiły się między koralowcami ze środowisk naturalnych i niewoli, sugerowały adaptację społeczności bakteryjnych śluzu do różnych warunków (Kooperman, 2007).

Zakłócenia w holobioncie koralowca mogą potencjalnie negatywnie wpłynąć na zdrowie koralowca. Zmienione struktury społeczności bakteryjnej powiązano zarówno z chorobą koralowców, jak i wybielaniem (Kvennefors, 2010). Blaknięcie koralowców następuje, gdy endosymbioza między koralowcami a ich symbiotami rozpada się podczas stresu (Ainsworth, 2008). Mimo to zmiany w składniku społeczności bakteryjnej holobionta mogą nie być bezpośrednią przyczyną bielenia koralowców. Podczas gdy społeczności bakteryjne odgrywają ważną rolę w zastoju i zdrowiu koralowców, stresory środowiskowe wydają się być głównymi czynnikami wyzwalającymi bielenie koralowców, a zaangażowanie bakterii we wzorce bielenia wydaje się być wynikiem kolonizacji oportunistycznej (Ainsworth, 2008).

„Probiotyczne” zastosowanie bakterii

„Probiotyk” można zdefiniować jako żywy dodatek drobnoustrojów, który oferuje korzyści zwierzętom, algom, roślinom, koralom lub otaczającej społeczności drobnoustrojów. Ta korzyść może być oceniona w kategoriach lepszego wykorzystania żywności (tj. zwiększonej wartości odżywczej), zwiększonej odporności na choroby lub poprzez poprawę jakości otaczającego środowiska (Verschuere et al., 2000). Wprowadzenie żywych kultur bakterii do akwarium morskiego można uznać za „probiotyczną” technikę hodowlaną.

Deterministyczne (nieprzypadkowe) czynniki wpływające na przeżywalność bakterii celowo wprowadzonych do akwarium morskiego obejmują zasolenie, temperaturę, stężenie tlenu oraz jakość i ilość dostępnych składników odżywczych. Na rozwój zbiorowiska drobnoustrojów w akwarium morskim mają również wpływ zjawiska stochastyczne (losowe): przypadek sprzyja organizmom znajdującym się we właściwym miejscu we właściwym czasie, aby mogły wejść do systemu i rozmnażać się, jeśli istnieją odpowiednie warunki. To właśnie ten stochastyczny aspekt wyjaśnia, dlaczego różne akwaria morskie mogą wyewoluować wyraźnie odmienne zbiorowiska drobnoustrojów, pomimo pojawienia się prawie identycznych warunków. Pomysł, że zarówno warunki środowiskowe, jak i losowy przypadek wpływają na powstawanie społeczności drobnoustrojów, stanowi kontekst dla koncepcji probiotyków jako biologicznych czynników kondycjonujących i kontrolnych. W okresie, w którym stabilna społeczność drobnoustrojów w akwarium morskim wciąż się rozwija, pojedynczy dodatek żywej kultury bakteryjnej może wystarczyć do osiągnięcia kolonizacji i trwałości w otaczającym środowisku, pod warunkiem, że dodawane szczepy są dobrze przystosowane do panujących warunków. warunki środowiska. Gdy środowisko posiada już względnie stabilną społeczność drobnoustrojów, bardziej prawdopodobne jest, że żywa kultura bakteryjna będzie musiała być regularnie dodawana w celu osiągnięcia sztucznie stabilnej obecności w społeczności drobnoustrojów (Verschuere et al 2000). W okresie, w którym stabilna społeczność drobnoustrojów w akwarium morskim wciąż się rozwija, pojedynczy dodatek żywej kultury bakteryjnej może wystarczyć do osiągnięcia kolonizacji i trwałości w otaczającym środowisku, pod warunkiem, że dodawane szczepy są dobrze przystosowane do panujących warunków. warunki środowiska. Gdy środowisko posiada już względnie stabilną społeczność drobnoustrojów, bardziej prawdopodobne jest, że żywa kultura bakteryjna będzie musiała być regularnie dodawana w celu osiągnięcia sztucznie stabilnej obecności w społeczności drobnoustrojów (Verschuere et al 2000). W okresie, w którym stabilna społeczność drobnoustrojów w akwarium morskim wciąż się rozwija, pojedynczy dodatek żywej kultury bakteryjnej może wystarczyć do osiągnięcia kolonizacji i trwałości w otaczającym środowisku, pod warunkiem, że dodawane szczepy są dobrze przystosowane do panujących warunków. warunki środowiska. Gdy środowisko posiada już względnie stabilną społeczność drobnoustrojów, bardziej prawdopodobne jest, że żywa kultura bakteryjna będzie musiała być regularnie dodawana w celu osiągnięcia sztucznie stabilnej obecności w społeczności drobnoustrojów (Verschuere et al 2000). pod warunkiem, że dodawane szczepy są dobrze przystosowane do panujących warunków środowiskowych. Gdy środowisko posiada już względnie stabilną społeczność drobnoustrojów, bardziej prawdopodobne jest, że żywa kultura bakteryjna będzie musiała być regularnie dodawana w celu osiągnięcia sztucznie stabilnej obecności w społeczności drobnoustrojów (Verschuere et al 2000). pod warunkiem, że dodawane szczepy są dobrze przystosowane do panujących warunków środowiskowych. Gdy środowisko posiada już względnie stabilną społeczność drobnoustrojów, bardziej prawdopodobne jest, że żywa kultura bakteryjna będzie musiała być regularnie dodawana w celu osiągnięcia sztucznie stabilnej obecności w społeczności drobnoustrojów (Verschuere et al 2000).

1.4 Liczenie bakterii w słupie wody

Badanie wszystkich problemów handlu bakteriami w akwarium rafowym, wymienionych w 1.1powyżej wymaga dostępu do jednej konkretnej metodologii eksperymentalnej; zdolność do liczenia bakterii w wodzie morskiej. Wyliczenie (liczenie) bakterii w próbkach wody morskiej okazało się kluczową wczesną technologią w rozwijaniu zrozumienia ekologicznego znaczenia populacji bakterii w różnych niszach środowiskowych (Robertson, 1989; Button, 1989; Troussellier, 1995; Marie, 1997). Wczesne (i późniejsze) próby ilościowego określenia bakterii morskich najpierw poprzez hodowanie ich w pożywce wzrostowej naśladowały podobne udane podejście mikrobiologów medycznych do hodowli bakterii chorobotwórczych ze specyficzną pożywką wzrostową, która z grubsza odtwarzała środowisko organizmu. Niestety brak uznania odpowiednich pożywek wzrostowych dla „środowiskowych” bakterii morskich, w przeciwieństwie do „ludzkich” bakterii, zaowocowało wydajnością hodowli nie lepszą niż zakres 1-10% (Porter, 2004). To ograniczenie jest nadal aktualne. W związku z tym zbadano alternatywne metody liczenia, które nie wymagały samodzielnej hodowli.

Jedno wczesne i całkiem udane podejście wykorzystywało bezpośrednie liczenie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (Hobbie, 1977). Ta technika nie wymaga niczego bardziej skomplikowanego koncepcyjnie niż „ręczne” liczenie bakterii widocznych za pomocą optyki mikroskopu. Aby wdrożyć tę metodologię liczenia, próbka wody jest filtrowana przez specjalny filtr poliwęglanowy o porach 0,2 μm, a wkładka filtracyjna obciążona bakteriami jest następnie badana pod specjalnym rodzajem mikroskopu. Bakterie, które nie przechodzą przez filtr, można następnie zliczyć za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania do analizy obrazu. Bakterie muszą być wybarwione w celu ich wizualizacji. Jest to technika „bezpośrednia”, która zapewnia bezwzględną liczbę bakterii obecnych w danej objętości próbki. Ma tę zaletę, że jest stosunkowo szybki i łatwy technicznie, i może odpowiadać za „zlepianie się” bakterii, jak to się czasem zdarza. W praktyce ma pewne ograniczenia, które mogą negatywnie wpłynąć na jego skuteczność. Na przykład pojawia się problem ograniczonej żywotności „plamy” – światło emitowane z mikroskopu spowoduje fotowybielanie związku barwiącego, czyniąc bakterie niewidocznymi, w skali czasu podobnej do tej, jaka jest potrzebna do zakończenia pomiaru. Ponadto cała powierzchnia filtra membranowego jest zbyt duża, aby można ją było zbadać, dlatego wybierane i liczone są tylko wybrane obszary. Następnie przyjmuje się różne założenia dotyczące jednorodności próbki, a algorytmy matematyczne są stosowane do surowego zestawu danych, aby umożliwić ekstrapolację ze zliczonych obszarów na cały dysk filtra w celu oszacowania całkowitej liczby. Zatem, istnieje znaczny poziom subiektywizmu, który towarzyszy pomiarom mikroskopii epifluorescencyjnej („Czy ten słaby punkt to bakteria, której plama wyblakła, czy jest to śmieci?” „Czy proces filtracji doprowadził do jednorodnego rozmieszczenia bakterii na filtrze, czy przesiąka ku zewnętrznej krawędzi okrągłego dysku?”). Niemniej jednak doświadczony operator może dość szybko wygenerować spójną liczbę bakterii. Jako przykład, ryc. 1 ilustruje wyniki barwienia/eksperymentu liczenia bakterii z wodą z 175-galonowego akwarium rafowego autora. Bakterie są wybarwione barwnikiem o nazwie SYBR1-Green (więcej o tym barwniku poniżej), a ta fotografia przedstawia jedno „pole” widzenia mikroskopu. Cały dysk filtracyjny o średnicy 25 mm składa się z około 10 000 takich pól. Zauważ, że istnieją znaczne różnice w wielkości i intensywności koloru zielonych „kropek”; jakie są bakterie?

Rycina 1. Zdjęcie, wykonane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego Olympus BX61, bakterii barwionych SYBR1-Green zebranych na krążku filtracyjnym 0,2 µm. Próbka wody pochodziła z 175-galonowego akwarium rafowego.

Druga niezależna technika liczenia bakterii w wodzie morskiej pojawiła się niedawno, po raz kolejny w środowisku mikrobiologii medycznej, jako alternatywa dla mikroskopii epifluorescencyjnej; ta nowsza metodologia nazywa się cytometrią przepływową(Robertson, 1989). Cytometria przepływowa, podobnie jak mikroskopia epifluorescencyjna, to technika bezpośredniego liczenia, która wymaga wstępnego barwienia bakterii. SYBR1-Green pojawił się jako barwnik (plam) z różnych powodów, z których nie najmniej ważnym jest (1) jego względna odporność na fotowybielanie oraz (2) fakt, że włącza się lub świeci na zielono , tylko gdy jest osadzony („interkalowany” jest prawidłowym terminem) w dwuniciowym DNA, patrz Ryc. 2 (Marie, 1997; Noble, 1998; Lebaron, 1998). Tak więc barwnik użyty w tych eksperymentach rejestruje się w detektorze tylko wtedy, gdy jest wstawiony do dwuniciowego DNA, jakie można znaleźć w próbkach biologicznych, takich jak bakterie, ale nie w losowych małych cząstkach śmieci.

Jedna z głównych zalet cytometrii przepływowej nad mikroskopią epifluorescencyjną wynika z faktu, że próbki wody surowej mogą być używane bez filtracji, co eliminuje możliwość przypadkowego sortowania próbek i utraty niektórych bakterii. Ponadto, włączenie do próbki kulek kalibracyjnych specyficznych dla rozmiaru umożliwia zgrubne określenie rozmiaru, dzięki czemu możliwe jest rozróżnienie „obiektów” i wykluczenie tych, które znajdują się poza danym (bakteryjnym) zakresem wielkości. Cytometria przepływowa wykorzystuje zaawansowany system przenoszenia płynów, który wykorzystuje ogniskowanie hydrodynamiczne w celu przepuszczenia próbki wody zawierającej bakterie, która zawiera znaną ilość dodanych kulek kalibracyjnych przez aperturę, tak aby cząstki (bakterie, kulki kalibracyjne, detrytus itp.) przeszły przez wiązkę laserową pojedynczy pilnik, ryc. 2. Wysokiej klasy optyka zbiera, a następnie skupia rozproszone światło z każdej cząsteczki. Czułe fotodetektory rozróżniają następnie rozproszenie i fluorescencję poszczególnych cząstek. Czas przebywania wybarwionej bakterii w wiązce laserowej jest na tyle krótki, że fotowybielanie nie stanowi problemu. Może co ważniejsze,wszystkie bakterie w danej objętości próbki można zliczyć zarówno szybko (~ 5 min dla próbki o objętości 1 ml), jak i obiektywnie, stosując standardowe parametry zliczania, które nie różnią się w zależności od próbki do próbki, od operatora do operatora lub dzień do dnia.

Rysunek 2. Schemat eksperymentu cytometrii przepływowej (ostateczny rysunek wykorzystano za zgodą Sysmex Corp.)

Operator cytometru musi zdecydować, które intensywności fluorescencji oparte na cząsteczkach uwzględnić lub wykluczyć. Bakterie, które utraciły DNA prawdopodobnie z powodu warunków środowiskowych, wykazywałyby bardzo słabą intensywność i dlatego mogłyby zostać przeoczone. Jednak po podjęciu decyzji o tym, co stanowi linię bazową dla intensywności do uwzględnienia w zliczeniu, ta wartość linii bazowej pozostaje stała dla kolejnych próbek i eksperymentów. Tak więc ta spójność, wraz z możliwością rozróżniania wielkości, dodaje kolejny poziom pewności, że obiekty liczone jako bakterie są w rzeczywistości bakteriami. Cytometria przepływowa ma pewne zobowiązania, które nie są wspólne dla mikroskopii epifluorescencyjnej; skomplikowane płyny mogą zostać zatkane przez zanieczyszczenia w słupie wody, a grudki bakteryjne, które są charakterystyczne dla niektórych rodzajów bakterii, można przeoczyć. Wreszcie, ponieważ cytometria jest zarówno techniką rozpraszania światła, jak i techniką pomiaru fluorescencji, minimalna wielkość cząstki, którą można wykryć, zależy od długości fali użytego światła i apertury optyki zbierającej; w naszych eksperymentach długości fal w zakresie 0,4 – 0,6 µm narzucają praktyczną dolną granicę rozróżniania wielkości cząstek około 0,5 µm, czyli bliżej dolnej granicy wielkości bakterii. Mikroskopia epifluorescencyjna również ma tę wadę; granice wykrywalności w mikroskopii są również ograniczone długością fali i jakością optyki mikroskopu. Ogólnie rzecz biorąc, szybkość, wygoda oraz obiektywny i bezstronny protokół zliczania zalecają cytometrię przepływową jako przydatną technikę zliczania bakterii w wodzie morskiej. Ostatnio,

Kilka raportów porównujących wyniki liczenia bakterii na podstawie mikroskopii epifluorescencyjnej z liczeniem bakterii na podstawie cytometrii przepływowej potwierdziło, że istnieją tylko nieistotne różnice między zmierzonymi populacjami bakterii zarówno w próbkach wody morskiej, jak i niemorskiej (Robertson, 1989; Monfort, 1992). W kolejnych eksperymentach technika cytometrii przepływowej jest wykorzystywana wyłącznie do liczenia bakterii w próbkach wody akwariowej (i innych).

2. Podejście eksperymentalne

Rysunek 3. Cytometr Coulter XL, prowadzony przez Alison Place (Pennsylvania State University).

Przystosowaliśmy do naszych badań procedury, które okazały się skuteczne w liczeniu bakterii w próbkach wody morskiej (Marie, 1999; Grégori, 2001). Protokół polega na pobraniu próbki wody w sterylnym naczyniu, utrwaleniu jej roztworem formaldehydu, dodaniu dokładnej ilości 6 ukulek liczących o średnicy m i barwnika SYBR1-Green do odmierzonej porcji próbki, a następnie przeprowadzając ją na cytometrze Coulter XL (patrz Ryc. 3). Dedykowane oprogramowanie do analizy danych zapewnia następnie bezpośrednie zliczenie zarówno kulek, jak i „bakterii” w danej objętości próbki wody. W tych eksperymentach zliczone „bakterie” obejmują każdą cząsteczkę, która spełnia następujące kryteria: (1) ma średnicę od ~0,5 do 6 µm, (2) zawiera dwuniciowe DNA i (3) nie spada do obszaru wykresu danych, w którym eksperymenty kontrolne wskazują, że pojawiają się tylko szczątki i/lub organizmy zawierające chlorofil (tj. fitoplankton), a nie bakterie (więcej szczegółów poniżej). „Policzalny” zakres wielkości ~ 0,5 – 6 µm został wybrany tak, aby pokrywał się z typowymi zakresami wielkości bakterii ze środowisk morskich; część fitoplanktonu prawdopodobnie „przecieknie” i również będzie liczona. Nie uważaliśmy, aby włączenie niektórych fitoplanktonu do ogólnej liczby bakterii było problemem, ponieważ oba te mikroorganizmy z kolumny wody mają zdolność usuwania TOC, a także mogą służyć jako pożywienie dla filtratorów i innych drapieżników. Większe organizmy (okrzemki, pierwotniaki rzęskowe, widłonogi itp.) nie będą liczone tą metodą, podobnie jak mniejsze organizmy (wirusy).

2.1 Ogólne eksperymentalne

Próbkę wody o objętości 25,0 ml pobrano do sterylnej probówki wirówkowej marki VWR i natychmiast dodano 0,5 ml 37% wodnego roztworu formaldehydu jako środka konserwującego. Probówkę zakorkowano, energicznie wytrząsano i umieszczono w zamrażarce w temperaturze -4 ^° C w oczekiwaniu na analizę. Jeśli ta próbka została pobrana z akwarium, starano się unikać wód powierzchniowych. Rurka została zanurzona do góry nogami około 4″ – 6″ poniżej powierzchni wody, szybko odwrócona, a następnie wyjęta z akwarium i opróżniona do objętości 25,0 ml. Inne próbki wody albo zostały zebrane na miejscu (ujście namorzynowe Florida Keys) za pomocą tej procedury, albo probówka została po prostu napełniona do poziomu 25,0 ml odpowiednią próbką wody (Aquafina, filtrowana RO/DI/0,2 µm, woda z kranuitp.) przed dodaniem formaldehydu. Próbki szybko rozmrożono przez zanurzenie w ciepłej wodzie tuż przed analizą. Po energicznym wytrząsaniu przez mieszadło Vortex, z każdej probówki pobrano trzy niezależne próbki 960 µl i umieszczono w sterylnych 2 ml probówkach do wirowania. W każdej probówce umieszczono 20,0 ul rozcieńczonego (patrz poniżej) roztworu SYBR1 Green, a następnie 20,0 – 60,0 ul roztworu 3,3 x 107 kulek/ml w ³ mM wodnym roztworze NaN ₃(jako środek bakteriobójczy) (objętość zależna od przewidywanej liczby bakterii). Roztwór podstawowy SYBR1 Green został świeżo przygotowany tuż przed każdym przebiegiem w następujący sposób: 20 µl dostępnego w handlu roztworu SYBR1 Green w DMSO (Invitrogen; dokładne stężenie jest zastrzeżoną informacją, ale zastosowane rozcieńczenie jest zgodne z ich sugerowanymi protokołami cytometrii) dodano do 380 µl wodnego roztworu DMSO, który został wytworzony z 40 µl DMSO + 360 µl RO/DI/0,2 µm przefiltrowanej wody. Ten roztwór energicznie wymieszano mieszadłem Vortex, przepuszczono przez dwa kolejne filtry 0,2 µm i użyto natychmiast. Roztwór kulek przygotowano przez dodanie 10 ul roztworu podstawowego 3,3 x ¹⁰⁸ kulek/ml (Polysciences) do 90 ul 3 mM wodnego roztworu _NaN3. Ten roztwór energicznie wymieszano mieszadłem Vortex i natychmiast użyto. Próbkę 1000 – 1040 µl (próbka wody + kulki + SYBR1 Green) wprowadzono do wlotu Coulter XL i rozpoczęto liczenie i monitorowano przez dedykowane oprogramowanie. Zauważ, że każda próbka wody była analizowana w trzech powtórzeniach.

2.2 Eksperymenty kontrolne i skażenie bakteryjne

Kilka z opisanych powyżej procedur przetestowano pod kątem możliwości wprowadzenia bakterii skażających, przeprowadzając odpowiednie kontrole. Na przykład, roztwór formaldehydu został wstępnie przefiltrowany przez filtr 0,2 µm przed użyciem, chociaż zaobserwowaliśmy, że ± ta obróbka filtracyjna nie doprowadziła do żadnej znaczącej różnicy w liczbie bakterii dla tej samej próbki wody. Testy pod kątem wprowadzenia bakterii przez skażone odczynniki lub przez zanieczyszczenie samego cytometru XL były przeprowadzane wraz z każdym przebiegiem. W tym teście zastosowano „ślepą próbę” złożoną z czystej przefiltrowanej wody RO/DI/0,2 µm, poddanej działaniu formaldehydu lub nie. We wszystkich przypadkach ślepa liczba bakterii wynosiła <10000/ml, aw większości eksperymentów <2000/ml. Dla porównania, rzeczywista liczba bakterii w wodzie morskiej była rzędu 10 ⁵– 10 ⁶ bakterii/ml. Wpływ zamrożenia próbek na liczbę bakterii zbadano, dzieląc próbkę na świeżą i zamrożoną oraz analizując obie próbki w różne dni. Nie zaobserwowano istotnych różnic między liczbą bakterii świeżych i mrożonych. Z drugiej strony pozostawienie próbki poddanej obróbce formaldehydem w temperaturze pokojowej na kilka dni przed analizą doprowadziło do około 10-20% spadku liczby bakterii w porównaniu ze świeżo analizowaną próbką.

2.3 Przetwarzanie danych

Rysunek 4. Widma absorpcyjne i emisyjne SYBR1-Green związanego z dwuniciowym DNA (z Wikipedii).

Cytometr przepływowy Coulter XL jest wyposażony w zaawansowaną elektronikę wewnętrzną, która oprócz dokładnego liczenia wspomaga jedną z podstawowych funkcji przyrządu; „bramkowanie” lub rozróżnianie między cząstkami w próbce w celu analizy określonych gatunków będących przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku bakterii i innych drobnoustrojów o podobnej wielkości. Ponieważ cytometria przepływowa zlicza cząstki niezależnie od objętości próbki, kulki o znanym stężeniu są liczone w tej samej objętości co bakterie, co pozwala na określenie objętości próbki zawierającej określoną liczbę bakterii (=> „stężenie” bakterii). Zastosowanie wskaźnika fluorescencyjnego SYBR1-Green zapewnia środki do identyfikacji, a następnie zliczania „obiektów” odpowiadających bakteriom. Dodatkowo dodane kulki kalibracyjne o średnicy 6,0 um, które są wybrane tak, aby miały cechy fizyczne, które pozwalają na łatwe odróżnienie ich od bakterii, są identyfikowane i liczone. Widmo emisyjne SYBR1-Green związanego z dwuniciowym DNA zilustrowano na Fig. 4 poniżej. Aby odróżnić rzeczywiste bakterie od detrytusu i fitoplanktonu o podobnej wielkości (do pewnego stopnia), mierzymy i wykreślamy intensywnośćzielona fluorescencja (530 nm, szczyt dużego piku zielonej linii) kontra czerwona fluorescencja(sygnał przy 610 nm). Zauważ, że dla SYBR1-Green, stosunek siły sygnału zielonego do czerwonego jest stały, ~ 7:1. Zatem każdemu wzrostowi intensywności zielonej fluorescencji (530 nm), który może towarzyszyć na przykład wielokrotnemu i niezależnemu wiązaniu kilku cząsteczek SYBR1-Green do dwuniciowego DNA pojedynczej bakterii, powinien odpowiadać proporcjonalny wzrost sygnał czerwony (610 nm); to znaczy, wykreślenie intensywności fluorescencji zielonej i czerwonej powinno dać linię prostą. W rzeczywistości wytwarza obszar eliptyczny na czerwono-zielonym wykresie zilustrowanym na reprezentatywnym cytogramie pokazanym na ryc. 5c poniżej. Zauważ, że uszkodzone lub zestresowane bakterie mogą mieć mniej zwinięte DNA, co może również zmienić stosunek zieleni do czerwieni.

Rysunek 5a. Reprezentatywne cytogramy. Wykresy FS/SS polistyrenowych kulek kalibracyjnych o precyzyjnych rozmiarach, wskazujące region na wykresie FS/SS, w którym można znaleźć cząstki wielkości bakterii.

Narysowany obwód na tym wykresie zielono-czerwonym (ryc. 5c) zawiera zliczone odpowiedzi. Wszystkie inne odpowiedzi detektora poza tym regionem są ignorowane. Jaka jest podstawa ignorowania tych innych odpowiedzi? W rzeczywistości istnieją dwa czynniki, które wpływają na wybór regionu do liczenia. (1) Zanieczyszczenia pochodzące od planktonu, w szczególności detrytus zawierający chlorofil, mają naturalną czerwoną autofluorescencję (Marie, 1999). Tak więc sygnały, które mają „zbyt dużo czerwieni”, tj. znajdują się poza liczoną elipsą w kierunku wyższego czerwonego końca, prawdopodobnie odzwierciedlają zanieczyszczenie fitoplanktonem/chlorofilem (lub ewentualnie innym czerwonym autofluorescencyjnym detrytusem). Cząstki te rzadziej są przykładami interesujących bakterii, którym brakuje chlorofilu, dlatego są pomijane. (2) Próby z czystej wody, w których nie występują żadne istotne bakterie, bada się w celu ustalenia podstawowego obszaru detrytusu na czerwono-zielonym poletku. Te niezależne od bakterii sygnały mają tendencję do gromadzenia się na niskim poziomieintensywność zielonej fluorescencji i w kierunku wyższego czerwonego końca (dolny prawy wykres czerwono-zielony Fig. 5b). Można ich łatwo uniknąć podczas określania liczby bakterii (= bramka L) przez wykluczenie ich ze zliczanego obszaru, jak pokazano na ryc. 5c. W praktyce możemy policzyć te „wykluczone” sygnały, używając danych na wykresie FS/SS (= cała populacja zliczonych sygnałów; FS = rozproszenie do przodu, SS = rozproszenie boczne) i zazwyczaj sygnały wykluczone (bakterie ) na wykresie czerwono-zielonym stanowią około 10 – 40 % całej populacji zliczonych sygnałów. Tak więc większość cząstek, które spełniają kryteria wielkości „bakterii”, jest w każdym przypadku liczona. Na przykład na ryc. 5c 10000 z możliwych 13647 sygnałów jest liczonych jako bakterie.

Rysunek 5b. Reprezentatywne cytogramy. Próbka wodna „wolna od bakterii” filtrowana RO/DI/0,2 µm, ilustrująca obszar cytogramu czerwono-zielonego, w którym znajdują się sygnały niebakteryjne.

Z tej analizy wynika, że podobnie jak w przypadku inspekcji wizualnej pod mikroskopem epifluorescencyjnym, operator przyrządu musi podjąć decyzję, które punkty danych odpowiadają prawidłowej liczbie bakterii, a które nie. Obie techniki wykorzystują barwnik (SYBR1-Green), który świeci się tylko po dołączeniu do obiektów zawierających dwuniciowe DNA, więc to wymaganie eliminuje większość odpadów o podobnej wielkości, ale niebakteryjnych. Jednak w przypadku cytometrii istnieje jedno dodatkowe i wartościowe kryterium wejściowe, które można wykorzystać do rozróżnienia bakterii; czerwone/zielone wykresy intensywności. W ten sposób można przeprowadzić drugą kontrolę niebakteryjnego detrytusu/fitoplanktonu.

Zliczenia z dwóch bramek zilustrowanych na cytogramie na ryc. 5c są istotne dla pytania o liczbę bakterii; bramka L, która wyświetla liczbę bakterii, oraz bramkę E, która wyświetla liczbę kulek. Przyrząd jest skonfigurowany tak, aby zatrzymać liczenie, gdy liczba bakterii osiągnie 10000 lub po upływie 300 sekund, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Pierwsze kryterium jest prawie zawsze osiągane w autentycznej wodzie morskiej, odzwierciedlając stosunkowo dużą (w porównaniu do ślepej próby) liczbę obecnych bakterii. W ślepych próbach wodnych zlicza się znacznie mniej bakterii i zwykle osiągany jest limit 300 sekund. Rzeczywista liczba wartości to liczba kulek z bramki E. Ponieważ znamy stężenie kulek w próbce, a cytogram podaje nam stosunek kulek zliczonych do bakterii zliczonych dla danej objętości próbki (ilość, która przechodzi, aż liczba bakterii osiągnie 10000), możemy użyć prostego współczynnika, aby uzyskać populację bakterii w znanej objętości próbki . Poniżej przedstawiono ilustrację obliczeń dla danych z rys. 5c:

Rysunek 5c. Reprezentatywne cytogramy. Typowa (odtłuszczona) próbka wody akwariowej; zilustrowano zarówno wykresy FS/SS, jak i czerwone/zielone. Liczba bakterii odpowiada obszarowi bramki L na czerwono-zielonym wykresie.

Populacja kulek: 3,29 x 107 ^kulek /ml wyjściowego stężenia roztworu podstawowego x 0,060 ml = 2,0 x 105 ^kulek dodanych do próbki. Objętość próbki = 0,960 mL + 0,060 mL (roztwór perełek) + 0,020 mL (roztwór SYBR) = całkowita objętość 1,040 mL, więc końcowe stężenie perełek = 2,0 x 105 ^perełek /1,040 mL = 1,9 x 105 ^perełek /mL.

Tak więc bakterie/ml = bakterie (bramka L)/kulki (bramka E) x 1,9 x 105 ^kulek /ml

Jednak nie uwzględniliśmy jeszcze ani (a) początkowego rozcieńczenia 25,0 ml próbki przez dodanie 0,5 ml formaldehydu, ani (b) rozcieńczenia tego roztworu woda/formaldehyd po dodaniu roztworu kulek i SYBR1- Zielone rozwiązanie. Zatem musimy pomnożyć powyższą ilość przez zarówno (a) 25,5 mL całkowitej objętości/25 mL objętości próbki (= 1,02) oraz (b) 1,040 mL całkowitej objętości/0,960 mL objętości próbki (= 1,08):

(1) Bakterie/mL = bramka L (liczba bakterii)/ bramka E (liczba kulek) x 1,9 x 10 ⁵ kulek/mL x 1,02 x 1,08

Równ. (1) to wzór, który pozwala nam uzyskać populację bakterii w próbce wody na podstawie surowych danych cytometru. W konkretnym przypadku zilustrowanym na rys. 5c,

bakterie/ml = 10000/2049 x 1,9×105 ^x 1,02 x 1,08 ~ 1,021,149 bakterii/ml. Znaczące ograniczenia liczbowe („0,060 ml” roztworu kulek podaje się tylko do 2 cyfr znaczących) wymagałyby, aby ta wartość była zgłaszana jako 1 000 000 bakterii/ml.

Każdą próbkę wody analizowano w trzech powtórzeniach, a uśrednione wartości z odchyleniem standardowym (chociaż nie mają zastosowania technicznego do zestawu danych z trzema próbkami) są podane w sekcji Wyniki poniżej.

3. Wyniki i dyskusja

3.1 Podstawowa liczba bakterii

Początkowe eksperymenty z liczeniem bakterii w zbiorniku rafowym koncentrowały się na ustaleniu linii bazowych dla populacji bakterii w różnych reżimach hodowlanych. Później te linie bazowe zostaną wykorzystane jako punkty porównawcze w eksperymentach, w których system jest zaburzony przez dozowanie węgla lub filtrację mechaniczną (szuming, GAC). Wiele wcześniejszych wysiłków w dziedzinie liczenia bakterii z autentycznej wody rafowej doprowadziło do ekspansywnego nakładu pracy. Kilka reprezentatywnych przykładów jest udokumentowanych w Tabeli 1, gdzie liczby bakterii z wody rafowej na Hawajach, Mikronezji, Key Largo i Wyspach Linii Północnej zbiegają się w zakresie populacji bakterii w zakresie 500K – 1500K/mL lub więcej. Obliczenia z Wysp Linii Północnej, Wyspy Ponape i Key Largo uzyskano z pomiarów mikroskopii epifluorescencyjnej, podczas gdy dane z Kaneohe Bay uzyskano za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto pobraliśmy próbki wody z ujścia lasów namorzynowych w Florida Keys i nic dziwnego, że ta silnie sedymentowana woda przybrzeżna wykazywała populację bakterii (3300-4400K/mL) znacznie wyższą niż ta obserwowana w bardziej dziewiczych wodach rafowych. Wartości te służą jako standardy w porównaniu z wodą akwariową i pomogą odpowiedzieć na pytanie: „Czy nasze zbiorniki rafowe są podobne, czy różnią się od autentycznej rafy w odniesieniu do populacji bakterii słupa wody?”

Druga seria liczenia bakterii koncentrowała się na kontrolnych próbkach wody różnego pochodzenia. Dane te reprezentują niskie standardy, które wyznaczają granice naszej techniki liczenia. Na przykład, każdemu przebiegowi eksperymentalnemu towarzyszyła ślepa próba z filtrowaną wodą RO/DI/0,2 µm, aby upewnić się, że sam przyrząd do cytometrii przepływowej nie jest źródłem zanieczyszczenia bakteryjnego. Wydawało się, że nie ma znaczenia, czy próbki te były traktowane konserwantem formaldehydowym, czy nie; podobne liczby uzyskano w obu przypadkach. Ogólnie rzecz biorąc, te „sterylne” próbki wody zwykle wykazywały liczbę w zakresie 1000 – 5000 bakterii/ml; sporadycznie obserwowano wartości dochodzące do 10000 bakterii/ml. Ponieważ liczba bakterii w autentycznych próbkach wody akwariowej lub morskiej była o 1-2 rzędy wielkości większa niż te wartości ślepe, doszliśmy do wniosku, że zanieczyszczenie instrumentu prawdopodobnie nie zwiększy w znaczący sposób mierzonej liczby bakterii. Zarówno woda butelkowana Aquafina, jak i woda RO/DI produkowana w 175-galonowym systemie uzupełniania wody w akwarium były prawie sterylne: < 1500 bakterii/mL. Z drugiej strony woda z kranu w State College Pennsylvania zawierała niewielkie ilości bakterii; 27 tys./ml.

Badane akwaria rafowe podzielone na dwa odrębne zestawy protokołów hodowlanych; agresywne i pasywne (patrz Rys. 6 dla zdjęć tych akwariów). Agresywne praktyki hodowlane obejmowały odpienianie białek, filtrację GAC i regularne podmiany wody w aktywnym wysiłku oczyszczania wody ze składników odżywczych. Podejście pasywne nie obejmowało żadnej z tych procedur. Co ciekawe, akwaria poddane pasywnej hodowli wykazywały liczbę bakterii, która mieściła się w zakresie obserwowanym na autentycznych rafach; 200 – 1000K/mL. Z drugiej strony, zbiorniki, które „skorzystały” ze starannego przyjrzenia się protokołom usuwania składników odżywczych, wykazywały liczbę bakterii/ml, która znacznie odbiegała od tych liczb; tylko 90-140K/mL. Oprócz monitorowania liczby bakterii w słupie wody zbadano również poziomy TOC (całkowitego węgla organicznego, patrz Feldman, 2008). Nie jest zaskoczeniem, zbiorniki z „nieoczyszczoną” wodą wykazywały poziomy TOC wyższe niż te obserwowane w zbiornikach z odtłuszczonym/filtrowanym GAC. Poziomy TOC w „oczyszczonych” akwariach mieszczą się w typowym zakresie TOC obserwowanym na autentycznych, zdrowych rafach (Feldman, 2008); zbiorniki do pasywnej hodowli były 2-3x wyższe.

Prawdziwą niespodzianką była obserwacja, że przynajmniej wśród tego małego zestawu badanych akwariów, woda w odtłuszczonych/przefiltrowanych zbiornikach miała tylko ~ 1/10 populacji bakterii, które miały nieodtłuszczone/niefiltrowane zbiorniki. Mówi o jednym aspekcie hodowli akwariów, w którym być może ważny parametr (?), jakim są bakterie w słupie wody z autentycznych i zdrowych raf, nie jest w ogóle skutecznie rozmnażany w tych domowych akwariach. Wrażliwe koralowce, takie jak Acropora , nie rozwijają się w badanych zbiornikach o wysokiej liczbie bakterii/o wysokim TOC, chociaż korale miękkiezrobić dobrze (patrz zdjęcia). Z drugiej strony koralowce SPS dobrze sobie radzą w zbiornikach o niskiej liczbie bakterii / niskim poziomie TOC (ryc. 6). Obserwacje te rodzą szereg pytań, z których najważniejszymi są być może: (1) „Czy liczba bakterii w słupie wody ma jakikolwiek związek z krótko- lub długoterminowymi perspektywami utrzymania SPS w akwariach w niewoli?” oraz (2) „ Jaki jest związek między TOC a populacją bakterii słupa wody?” Pierwsze pytanie, choć być może bardziej interesujące, pozostaje bez odpowiedzi. To ostatnie pytanie (TOC vs populacja bakterii), związane z dawkowaniem węgla, zostanie omówione poniżej.

Tabela 1. Liczba bakterii z autentycznej wody morskiej, różnych próbek kontrolnych i kilku zbiorników rafowych.
Próbka	Objętość wody (gal)	cedzidło	GAC	GFO	Podmiana wody	OWO ppm	Piaskownica	Bakterie/ml
^a Monger, 1993 ^b Dinsdale, 2008 ^c Yoshinaga, 1991 ^d Paul, 1993 ^e Ta praca
Kaneohe Bay, ^Hawaje								800-1500K
Wyspy Linii Północnej ^b								50 – 800K
Wyspa Ponape, Mikronezja ^c								800-1600K
Key Largo, Floryda ^.								300-1000K
Ujście namorzynowe, Fl. Klawisze ^e								3300-4400K
RO/DI/0,2 µM przefiltrowana H ₂ O								1-10K
KSF RO/DI								1,1 ± 0,3 K
Aquafina								1,5 ± 0,5 K
Woda z kranu State College PA								27±6K
Sanjaya 55	55	nie	nie	nie	rzadko	2.72	nie	590±70K
Sanjaya 29	29	nie	nie	nie	rzadko	1.69	nie	1000±80K
Sanjay 28	28	nie	nie	nie	rzadko	2.14	TAk	220±10K
KSF 175	168	TAk	TAk	TAk	17%/wk	0.50	TAk	105±10K
PSU HUB 500	500	TAk	TAk	TAk	10%/wk	1.0	TAk	91±13K
Sanjay 500 Zeovit	500	TAk	TAk	TAk	14%/2-3 tyg.	0.90	TAk	140±10K

Akwaria rafowe, które były monitorowane pod kątem ich populacji bakterii:

Rysunek 6a. Zbiornik rafowy KSF o pojemności 175 galonów

Rysunek 6b. 500-galonowy zbiornik rafowy SJ

Rysunek 6c. 55-galonowy zbiornik rafowy SJ

Rysunek 6d. SJ 29 galonowy zbiornik rafowy

Liczba bakterii/ml dla akwariów opisanych w Tabeli 1 odzwierciedla pomiary w jednym punkcie czasowym i możliwe jest, że godzinowe, dzienne lub inne wahania w populacjach bakterii zostały pominięte. Te modulacje w populacjach bakterii mogą wynikać z cyklu włączania/wyłączania światła, dodawania pokarmu, wahań pH itp. Aby zbadać ten punkt, przeprowadzono kilka wieloletnich badań podłużnych zarówno na 175-galonowej rafie zbiornik i 55-galonowy zbiornik rafowy. Pierwszy eksperyment obejmował 5 dni typowego życia akwarium, z celowo wyłączonym skimmerem przez pierwsze trzy dni, włączonym sterylizatorem UV i włączonymi filtrami GAC i GFO, ryc. 7. W trakcie tego eksperymentu bakterie słupa wody populacja wahała się od ~95K do 115K bakterii/ml, z ~20% rozpiętością wartości. Skimmer został wyłączony przy t=0, i liczba rosła gwałtownie w ciągu następnych 12 godzin, a następnie spadła do punktu początkowego na znak 2 dni. W tym momencie nastąpił stopniowy wzrost do maksymalnej zarejestrowanej wartości 115K/mL. Ponowne włączenie skimmera po 3,5-dniowym znaku mogło nieco spowolnić tempo tego wzrostu, ale dane nie są przekonujące w tym punkcie.

Ryc. 7. Liczba bakterii/mL w 175-galonowym zbiorniku rafowym (Patrz Ryc. 6) w ciągu 5 dni. Zbiornik był karmiony 3-4 razy dziennie (krewetka PE mysis, krewetka Hikari mysis, pokarm w płatkach i pokarm w granulkach) podczas części „włączonej” dziennego cyklu oświetlenia.

Kuszące jest przypisanie początkowego gwałtownego wzrostu przypuszczalnemu odpowiadającemu wzrostowi TOC źródła węgla, ponieważ odpieniacz usuwający TOC został wyłączony w t = 0. Podczas tej fazy wzrostu składniki odżywcze azotu i fosforu, a także C zostałyby pozbawione również z kolumny wody. W tej interpretacji, późniejszy spadek populacji bakterii po 12 godzinach może odzwierciedlać ubytek tych składników odżywczych N i P wymaganych do wzrostu populacji bakterii; to znaczy, być może początkowy zryw wzrostu może odzwierciedlać wzrost stężenia C (odpieniacz) w reżimie wzrostu bakterii ograniczającym C, a późniejszy spadek po 12 godzinach może wskazywać na przejście do reżimu wzrostu ograniczonego N i/lub P . Ta hipoteza dobrze współgra z opisanymi wcześniej pomysłami dotyczącymi dozowania węgla. Jednakże, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że samo obserwowanie oczekiwanego wyniku hipotezy nie potwierdza tej hipotezy – najsilniejszym wnioskiem, który można wysunąć zgodnie z prawem, jest po prostu to, że dane są zgodne z przewidywaniami hipotezy. W tym momencie nie można wykluczyć innych interpretacji danych dotyczących populacji bakterii z ryc. Co więcej, „odbicie” wzrostu bakterii po 2 dniach jest trudniejsze do zinterpretowania bez dalszej wiedzy na temat proporcjonalnych poziomów C, N i P w zbiorniku. Bardziej kontrolowany plan eksperymentalny monitorowania zmian populacji bakterii jednocześnie z pomiarami stężeń C i N może rozwiązać ten problem; ten eksperyment zostanie omówiony wkrótce.

Rysunek 8. Badanie wpływu sterylizacji UV na populacje bakterii w wodzie 175-galonowego zbiornika rafowego. W tym doświadczeniu zastosowano również schemat żywienia opisany na rys. 7.

Jeden niepokojący punkt w eksperymencie opisanym na ryc. 7 dotyczy roli, jaką sterylizator UV może odgrywać w wpływaniu na poziom bakterii; Czy zabijamy znaczną liczbę bakterii przez obróbkę UV, hamując w ten sposób wzrost populacji? Stosowany sterylizator UV to model przepływowy o mocy 57 W firmy Aqua Ultraviolet. Aby zbadać to pytanie, ponownie przeprowadziliśmy eksperyment „tydzień z życia” z wyłączonym sterylizatorem UV, ale odpieniacz włączony w sposób ciągły, ryc. 8. Zaobserwowane wartości bakterii/ml w ciągu 5 dni wahała się od 60K do 90K (~50% zmiany) w tym konkretnym okresie. W związku z tym, gdy sterylizator UV był wyłączony, nie stwierdzono znaczącego wzrostu populacji bakterii w słupie wody,

Ryc. 9. Liczba bakterii/mL w 55-galonowym zbiorniku rafowym (patrz Ryc. 6) w ciągu 5 dni. W tym zbiorniku nie stosowano odpieniania białek ani filtracji GAC. Zbiornik był codziennie karmiony mrożonymi krewetkami mysis. Ponadto przez 6 miesięcy obowiązywał reżim dawkowania wódki wynoszący 4 ml 80 dowodów/dzień (= 3 ppm C/dzień).

Ostatni eksperyment „tydzień z życia” przeprowadzono na 55-galonowym zbiorniku bez aktywnej filtracji, rys. 9. Dodatkowo, zbiornik ten był codziennie przez 6 miesięcy traktowany wódką jako źródłem węgla przed wodą. usuwanie. To dodawanie wódki rozpoczęło się po pobraniu pierwotnego odczytu populacji bakterii przedstawionego w Tabeli 1. Ponieważ nie było aktywnego mechanizmu usuwania bakterii (tj. szumowania), nie było a priori jasne, jak populacja bakterii może się zmienić w porównaniu z wartością 590±70 K/mL sprzed wódki. W rzeczywistości populacja bakterii wyraźnie wzrosła do znacznie wyższego poziomu niż obserwowana w okresie przed wódką, a teraz oscylowała wokół 1500-2500K/mL. Ponownie, znaczące (~ 60%!) wahania liczby bakterii/ml w czasie wydają się być normą, przynajmniej dla dwóch badanych akwariów.

Ogólnie rzecz biorąc, główne wnioski z tych wstępnych badań dotyczących wyjściowej liczby bakterii są następujące:

Aktywnie oczyszczone akwaria mają populacje bakterii słupowych, które stanowią około 1/10 ^populacji autentycznie zdrowych raf.
W nieoczyszczonych akwariach populacje bakterii w słupie wody są w przybliżeniu takie same jak w autentycznych zdrowych rafach.
Sterylizacja UV nie wpływa znacząco na populacje bakterii w wodzie akwariowej.
Występują znaczne wahania (20-50%) w mierzonych populacjach bakterii słupa wody w kilkudniowej skali czasu w akwariach.

3.2 Dozowanie węgla (planowane i niezamierzone) – Jak wpływa na poziom bakterii w słupie wody?

Dane z sekcji 3.1ustalili, że akwaria z filtracją odtłuszczoną/GAC wykazywały podstawową liczbę bakterii/ml w zakresie 70-140K/mL, podczas gdy zbiorniki beztłuszczowe/bez GAC miały około 10-krotność tej ilości. Co więcej, codziennie poziom bakterii wahał się nawet o 20 – 50%. Teraz nadszedł czas, aby zbadać, jak te podstawowe poziomy bakterii/ml zareagowały na celowe dodanie węgla. Jeśli wzrost populacji bakterii jest ograniczony pod względem węgla, możemy spodziewać się znacznego wzrostu. Jeśli tak nie jest, liczebność populacji bakterii nie powinna zwiększać się wraz z dawką węgla. W pierwszej próbie usunęliśmy 30 galonów wody z akwarium KSF około 17 godzin po ostatnim karmieniu i około 1 godzinę po zapaleniu światła. Ta próbka wody została umieszczona w odkrytej wannie Rubbermaid z ciągłym mieszaniem z głowicą napędową. Fakt, że wanna została odkryta, może prowadzić do wprowadzenia bakterii ze źródeł powietrznych; czuliśmy, że ta konfiguracja najlepiej oddaje sposób, w jaki akwarysta może faktycznie prowadzić swój aparat do akwarium/zmiany wody. Etanol (EtOH) dozowano z szybkością 0,29 ml/dzień (= 1 ppm C/dzień). Próbki wody usuwano tuż przed każdą dawką EtOH w ciągu 5 dni. Ponadto w tym okresie mierzono poziomy TOC, a początek i koniec [NIE₃ ] wartości przekodowano za pomocą zestawu Salifert. Poziom [PO4 _] był niemożliwy do zmierzenia za pomocą zestawu Merck (<0,024 ppm). Wyniki przedstawiono na rys. 10.

Rysunek 10. Zmiany liczby bakterii/ml i poziomów TOC w 30-galonowej objętości wody w zbiorniku rafowym KSF (patrz Rys. 6) po codziennym dozowaniu EtOH z szybkością 0,29 ml/dzień (= 1 ppm C/dzień) . Woda ta znajdowała się w odkrytej wannie Rubbermaid wyposażonej w dwie głowice zasilające i wystawionej na fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia.

Początkowa populacja bakterii/mL wzrosła z 80K/mL przed pierwszą dawką EtOH do około 1200K/mL (~15-krotny wzrost) w ciągu dnia i maksymalizowała przy 3900K/mL (~50-krotny wzrost) po 2 dniach. Poziom bakterii spadł następnie do około 1500K/ml (~19-krotny wzrost) po 5 dniach. Zmiany poziomu TOC rozpoczęły się przewidywalnie; początkowy poziom = 0,61 ppm, a zaraz po dodaniu (znak 3,5 h) 0,29 ml EtOH (~ 1 ppm C) zarejestrowany poziom TOC wzrósł do 1,58 ppm. Tak więc dodanie EtOH w rzeczywistości podniosło poziom TOC do oczekiwanej ilości – wewnętrzna kontrola metodologii pomiaru. Ciekawa i potencjalnie odkrywcza obserwacja pojawiła się po 1-dniowym znaku; ciągłe dodawanie EtOH nie doprowadziło do wzrostu poziomu TOC w 2. i 3. dniu, a jedynie nieznaczny wzrost (~33%) w 5. dniu.₃ ] wartość spadła z 2,5-5 ppm na początku eksperymentu do 1-2,5 ppm w dniu 5. Niepewność odczytu wyników zestawu Salifert utrudnia wyciągnięcie ostatecznych wniosków na temat redukcji azotanów w tym eksperymentalnym przebiegu czasu.

Obserwacje te można interpretować w kontekście opisanej wcześniej hipotezy o dozowaniu węgla, a konkretnie początkowej przesłanki, że dodanie źródła metabolizowanego węgla doprowadzi do wzrostu populacji bakterii (tj. wzrost bakterii jest ograniczony do C w wodzie akwariowej). W ciągu pierwszych 2 dni wzrost bakterii odpowiada zgodnie z przewidywaniami tej hipotezy. Ponadto zachowanie TOC można zracjonalizować również w świetle tej hipotezy; początkowy i kolejny dzień 2 dodawania EtOH (= TOC) są konsumowane przez bakterie, zarówno napędzając wzrost, jak i wyczerpując lub przynajmniej stabilizując pulę TOC. Chociaż ładunek TOC w nienaruszonych bakteriach zostanie odebrany przez analizator TOC, prawdopodobne jest, że normalny metabolizm bakterii przekształci dużą część tego TOC w CO ₂, które nie zostaną wykryte przez analizę TOC. Jednak po około 2 dniach zmienia się sytuacja dynamiczna w tej objętości wody; populacja bakterii spada, a poziom TOC zaczyna rosnąć. Być może w tym momencie wzrost populacji bakterii nie jest już ograniczony węglem, a więc dalsze dodawanie węgla nie napędza wzrostu. Kontynuując tę spekulację, być może w obecności nadmiaru węgla, rozwój bakterii jest teraz ograniczony dostępnością jakiegoś innego składnika odżywczego (N lub P). W tej interpretacji wzrost populacji bakterii w dniach 1 i 2 spowodowałby ubytek N i/lub P z wody na tyle, że jeden (lub oba) z tych składników odżywczych są obecnie niedoborowe z punktu widzenia bakterii. Oczywiście z perspektywy akwarysty

Próbowaliśmy powtórzyć ten eksperyment, biorąc pod uwagę nasze zastrzeżenie z góry („obserwowanie oczekiwanego wyniku hipotezy nie potwierdza tej hipotezy – najsilniejszym wnioskiem, który można legalnie przedstawić, jest po prostu to, że dane są zgodne z przewidywaniami hipotezy”) . Jednak w tej drugiej próbie włączyliśmy eksperyment kontrolny do testowania znaczenia samego dodatku EtOH dla wzrostu bakterii. Konkretnie, przeprowadziliśmy eksperyment z próbką wody o pojemności 30 galonów dokładnie tak, jak opisano dla Próby 1, a dane przedstawiono jako linie wodne (bakterie/ml) i niebieskie (TOC) na ryc. 11. Dane te ściśle odpowiadają tym z Próby 1 ; początkowy szybki wzrost populacji bakterii (~30x poziom początkowy) w ciągu pierwszego dnia, po którym następuje niewielki spadek w ciągu następnych kilku dni. Odpowiedź poziomu TOC była również zgodna z Próbą 1;

Ryc. 11. Druga próba rejestrująca zmiany liczby bakterii/ml i poziomów TOC w 30-galonowej objętości wody w zbiorniku rafowym KSF (patrz Ryc. 6) po codziennym dozowaniu EtOH z szybkością 0,29 ml/dzień (= 1 ppm C/dzień). Woda ta znajdowała się w odkrytej wannie Rubbermaid wyposażonej w dwie głowice zasilające i wystawionej na fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia. W tym eksperymencie próbkę wody kontrolnej usunięto i trzymano z boku w plastikowym naczyniu bez dodatku EtOH.

spadek, gdy wzrost bakterii osiągnął szczyt, a następnie niewielki wzrost, gdy (być może) populacja bakterii weszła w fazę wzrostu nieograniczoną przez C.

Prawdziwą niespodzianką jest czerwona linia na ryc. 11; dokumentuje znaczny wzrost liczby bakterii/ml w kontrolnej próbce wody, która nie została potraktowana EtOH. Na początku eksperymentu po prostu usunęliśmy około ½ galona wody z wanny i umieściliśmy ją w otwartym pojemniku Tupperware pod fluorescencyjnym oświetleniem pokoju. Ta kontrolna część wody w zbiorniku była pobierana codziennie pod kątem zawartości bakterii, podobnie jak próbka wody z większego zbiornika poddanego obróbce EtOH. Co godne uwagi, populacja bakterii w tej próbce kontrolnej doświadczyła wolniejszego, ale nadal znaczącego wzrostu, zwiększając się do maksymalnie ~ 27x pierwotnego poziomu po 3 dniach. Co napędza ten rozwój bakterii? Ponieważ ustaliliśmy już, że populacja bakterii w tej próbce wody akwariowej jest ograniczona do węgla, wydaje się rozsądne postawić hipotezę, że samo naczynie Tupperware dostarcza metabolizowanego źródła węgla! To naczynie było wcześniej używane do różnych transferów wody, a między użyciami było płukane wodą z kranu i suszone. Czy pozostałości organiczne lub błony bakteryjne mogą pokryć plastik? Czy plastik sam w sobie jest „strawny” dla bakterii słupa wody? Na te pytania nie ma obecnie odpowiedzi, ale ogólna obserwacja, że sam plastikowy pojemnik (lub osad na jego powierzchni), a niekoniecznie dodatek EtOH, może przyczynić się do znacznego wzrostu populacji bakterii słupa wody, budzi pewne obawy co do interpretacji wyniki na ryc. 10 (pamiętaj o zastrzeżeniu). i był płukany wodą z kranu i suszony pomiędzy użyciami. Czy pozostałości organiczne lub błony bakteryjne mogą pokryć plastik? Czy plastik sam w sobie jest „strawny” dla bakterii słupa wody? Na te pytania nie ma obecnie odpowiedzi, ale ogólna obserwacja, że sam plastikowy pojemnik (lub osad na jego powierzchni), a niekoniecznie dodatek EtOH, może przyczynić się do znacznego wzrostu populacji bakterii słupa wody, budzi pewne obawy co do interpretacji wyniki na ryc. 10 (pamiętaj o zastrzeżeniu). i był płukany wodą z kranu i suszony pomiędzy użyciami. Czy pozostałości organiczne lub błony bakteryjne mogą pokryć plastik? Czy plastik sam w sobie jest „strawny” dla bakterii słupa wody? Na te pytania nie ma obecnie odpowiedzi, ale ogólna obserwacja, że sam plastikowy pojemnik (lub osad na jego powierzchni), a niekoniecznie dodatek EtOH, może przyczynić się do znacznego wzrostu populacji bakterii słupa wody, budzi pewne obawy co do interpretacji wyniki na ryc. 10 (pamiętaj o zastrzeżeniu).

Obserwacje te skłoniły do bardziej bezpośredniego zbadania zdolności wanny Rubbermaid do przyczyniania się do rozwoju bakterii — być może naczynie Tupperware było wyjątkowo zanieczyszczone substancjami organicznymi. W tym eksperymencie usunęliśmy próbkę wody o pojemności 30 galonów z akwarium KSF i przenieśliśmy ją do odkrytej wanny Rubbermaid, jak opisano wcześniej. Cyrkulację wody zapewniały głowice, ale poza tym system pozostał niezakłócony. Próbki wody były pobierane codziennie przez 5 dni, a liczbę bakterii/ml pokazano na Ryc. 12. Widać wyraźnie, że sama wanna (lub pokrywający ją materiał organiczny) zapewnia odpowiednie źródło węgla do wzrostu bakterii. Populacja bakterii wzrasta około 26-krotnie w stosunku do wartości początkowej w ciągu 2,3 dnia, po czym nieznacznie spada; Obecnie nie można podać uzasadnienia dla wzrostu populacji bakterii w 5 dniu.

Rysunek 12. Liczba bakterii/ml w eksperymencie kontrolnym, w którym 30 galonów wody ze zbiornika KSF usunięto i umieszczono w wannie Rubbermaid. Dołączono odpieniacz proteinowy Bubble King mini 160 i dwie głowice, chociaż odpieniacz nie był włączony. Nie dodano EtOH; próbkę wody wystawiono na działanie powietrza i fluorescencyjnego oświetlenia pomieszczenia.

Czy te eksperymenty kontrolne zaprzeczają hipotezie o dozowaniu węgla? Nie. Wyniki te sugerują jedynie, że KAŻDE metabolizowane źródło węgla, niezależnie od tego, czy jest to nieznana „substancja” organiczna z powierzchni wanny Rubbermaid, czy celowo dodany EtOH, będzie napędzać wzrost bakterii w środowisku o ograniczonym stężeniu węgla, takim jak, najwyraźniej, woda akwariowa. Wannę Rubbermaid czyszczono wodą z kranu, a następnie wodą destylowaną między użyciami. Wszelkie nagromadzone ciało stałe usunięto przez spłukanie 1 M HCl, a następnie wodą destylowaną. Tak więc ten protokół, który może odzwierciedlać typowe procedury stosowane przez akwarystów w przypadku pojemników na wodę uzupełniającą lub słoną, wyraźnie przyczynia się do tworzenia środowiska bogatego w substancje organiczne, które sprzyja rozwojowi bakterii.

Obserwacja, że plastikowy pojemnik, który jest ponownie używany w trakcie normalnej hodowli akwariów, może przyczynić się do wzrostu bakterii w postaci węgla, otworzyła nowy kierunek dociekań; jaką rolę mogą odgrywać standardowe podmiany wody, które wykorzystują takie pojemniki, w modulowaniu (zwiększaniu) poziomu bakterii w wodzie ze zbiorników rafowych? W szczególności, czy woda podmieniana może wprowadzić do akwarium znaczące populacje bakterii? To pytanie zostało zbadane przez proste monitorowanie liczby bakterii/ml w 30-galonowej próbce słonej wody o zasoleniu 35 ppt poprzez zmieszanie mieszanki soli Instant Ocean Reef Crystals z 30 galonami wody destylowanej w luźno zamkniętym pojemniku na śmieci firmy Rubbermaid (innym niż wanna używane w poprzednich eksperymentach). Ten pojemnik był używany do cotygodniowych podmian wody przez ostatnie 6 lat. Po każdym transferze wody pojemnik został przemyty wodą destylowaną i wytarty do sucha przed zmieszaniem kolejnej porcji słonej wody. Co więcej, był on okresowo czyszczony 1M HCl w celu usunięcia osadów stałych, ale ogólnie zawierał pewne stałe pozostałości na powierzchni tworzywa sztucznego. Dane (ryc. 13) jednoznacznie pokazują, że rzeczywiście ta świeżo zmieszana słona woda jest głównym źródłem wprowadzania bakterii do zbiornika rafowego KSF. Początkowa woda destylowana wykazywała znikomą populację bakterii (~10K/mL), ale ta wartość wzrosła dramatycznie do ponad 900K/mL w zaledwie jeden dzień po dodaniu IORC. Wartość bakterii/mL spadła i ustabilizowała się na poziomie ~500K – 600K/mL do dnia 2. Tak więc przygotowanie słonej wody IORC w typowych warunkach hodowli akwariowej prowadzi do znacznego obciążenia bakteriami, napędzanego przez jakieś niezidentyfikowane źródło węgla, chociaż należy zauważyć, że IORC zawiera „dodatkowe witaminy”, które mogą służyć jako źródło paliwa z węgla organicznego. Populacja bakterii osiągnęła szczyt w tym eksperymencie około 1 dnia, co sugeruje, że dodanie tej słonej wody do akwarium po jednym dniu mieszania, w ramach rutynowej wymiany wody, może służyć jako niedrogi, prosty i funkcjonalnie użyteczny sposób wprowadzić bakterie. Ta przesłanka została następnie przetestowana.

Rysunek 13. Liczba bakterii/ml w 30 galonach słonej wody (zasolenie = 35 ppt) zmieszanych w 35-galonowym pojemniku na śmieci firmy Rubbermaid; słona woda została przygotowana z Instant Ocean Reef Crystals (IORC) i wody destylowanej. Pojemnik był luźno przykryty; woda była ciągle mieszana za pomocą głowicy napędowej i podgrzewana do 75 stopni za pomocą grzałki.

Czy dodanie bogatej w bakterie słonej wody do akwarium rafowego zwiększa jego obciążenie bakteryjne? To pytanie zostało zbadane przez eksperyment opisany na ryc. 14. W ramach rutynowej, cotygodniowej konserwacji zbiornika, z akwarium KSF usunięto 30 galonów wody i natychmiast 30 galonów słonej wody IORC (w tym przypadku liczba bakterii = 280K/mL) zostało dodane. Liczba bakterii w zbiorniku KSF/ml była monitorowana codziennie przez tydzień; w połowie tego eksperymentu przeprowadzono drugą mniejszą wymianę wody na słoną wodę Instant Ocean (liczba bakterii nie została zmierzona). Aktywna filtracja (skimmer/GAC/UV) była włączona przez cały tygodniowy kurs. Jak pokazano na rys. 14, populacja bakterii w zbiorniku doświadczyła gwałtownego wzrostu po dodaniu bogatej w bakterie słonej wody podmieniającej wodę; po 2 godzinach od dodania słonej wody IORC, liczba wzrosła o 1,7x. Podobnie, 1 dzień po dodaniu IO słonej wody, liczba ponownie wzrosła, również o 1,7x. Tak więc dodanie bogatej w bakterie słonej wody rzeczywiście prowadzi do zauważalnego i znacznego wzrostu populacji bakterii w zbiorniku. W rzeczywistości matematyka rozcieńczeń działa doskonale i służy jako wewnętrzna kontrola metodologii liczenia, podobnie jak w przypadku analizy TOC Figs. 10 i 11. W szczególności cała objętość wody w zbiorniku wynosi 168 galonów. Dodanie 30 galonów 280 000 bakterii/mL do 138 galonów wody w zbiorniku (całkowita objętość – ilość usunięta podczas zmiany wody) 61 000 bakterii/mL powinno prowadzić do przewidywanej końcowej objętości 168 galonów przy 100 000 bakterii/mL – 2 godziny po wodzie zmiany, bakterie/ml zmierzono przy 101±5K/ml. także o 1,7x. Tak więc dodanie bogatej w bakterie słonej wody rzeczywiście prowadzi do zauważalnego i znacznego wzrostu populacji bakterii w zbiorniku. W rzeczywistości matematyka rozcieńczeń działa doskonale i służy jako wewnętrzna kontrola metodologii liczenia, podobnie jak w przypadku analizy TOC Figs. 10 i 11. W szczególności cała objętość wody w zbiorniku wynosi 168 galonów. Dodanie 30 galonów 280 000 bakterii/mL do 138 galonów wody w zbiorniku (całkowita objętość – ilość usunięta podczas zmiany wody) 61 000 bakterii/mL powinno prowadzić do przewidywanej końcowej objętości 168 galonów przy 100 000 bakterii/mL – 2 godziny po wodzie zmiany, bakterie/ml zmierzono przy 101±5K/ml. także o 1,7x. Tak więc dodanie bogatej w bakterie słonej wody rzeczywiście prowadzi do zauważalnego i znacznego wzrostu populacji bakterii w zbiorniku. W rzeczywistości matematyka rozcieńczeń działa doskonale i służy jako wewnętrzna kontrola metodologii liczenia, podobnie jak w przypadku analizy TOC Figs. 10 i 11. W szczególności cała objętość wody w zbiorniku wynosi 168 galonów. Dodanie 30 galonów 280 000 bakterii/mL do 138 galonów wody w zbiorniku (całkowita objętość – ilość usunięta podczas zmiany wody) 61 000 bakterii/mL powinno prowadzić do przewidywanej końcowej objętości 168 galonów przy 100 000 bakterii/mL – 2 godziny po wodzie zmiany, bakterie/ml zmierzono przy 101±5K/ml. W rzeczywistości matematyka rozcieńczeń działa doskonale i służy jako wewnętrzna kontrola metodologii liczenia, podobnie jak w przypadku analizy TOC Figs. 10 i 11. W szczególności cała objętość wody w zbiorniku wynosi 168 galonów. Dodanie 30 galonów 280 000 bakterii/mL do 138 galonów wody w zbiorniku (całkowita objętość – ilość usunięta podczas zmiany wody) 61 000 bakterii/mL powinno prowadzić do przewidywanej końcowej objętości 168 galonów przy 100 000 bakterii/mL – 2 godziny po wodzie zmiany, bakterie/ml zmierzono przy 101±5K/ml. W rzeczywistości matematyka rozcieńczeń działa doskonale i służy jako wewnętrzna kontrola metodologii liczenia, podobnie jak w przypadku analizy TOC Figs. 10 i 11. W szczególności cała objętość wody w zbiorniku wynosi 168 galonów. Dodanie 30 galonów 280 000 bakterii/mL do 138 galonów wody w zbiorniku (całkowita objętość – ilość usunięta podczas zmiany wody) 61 000 bakterii/mL powinno prowadzić do przewidywanej końcowej objętości 168 galonów przy 100 000 bakterii/mL – 2 godziny po wodzie zmiany, bakterie/ml zmierzono przy 101±5K/ml.

Rysunek 14. Liczba bakterii/mL w zbiorniku rafowym KSF po zmianach wody 17% (Instant Ocean Reef Crystals), a następnie 7% (Instant Ocean).

Bardziej interesującą obserwacją jest to, co dzieje się po dodaniu bolusa bakterii wraz z podmianą wody. Po obu podmianach wody ~1,7-krotny wzrost liczby bakterii spadł z powrotem do wartości „podstawowej” dla akwarium KSF wynoszącej ~60-70K/mL w ciągu jednego dnia. Populacja bakterii w dowolnym momencie będzie określona przez wzajemne oddziaływanie zdarzeń zwiększających populację (bezpośrednie dodanie bakterii i wzrost, jeśli jest to właściwe i wystarczające składniki odżywcze) oraz zdarzeń zmniejszających populację, takich jak śmierć i drapieżnictwo przez wyższe organizmy w żywności łańcuch. Fakt, że szybki wzrost liczby bakterii jest równie szybko „wchłaniany”, aby utrzymać poziom równowagi, przemawia za dynamiczną naturą tych zdarzeń. Większe mikrofauny i filtry osadzkowe wydają się być prawdopodobnymi kandydatami do usuwania bakterii, które wspólnie równoważą wszelkie wywołane wzrosty populacji. Poziom dodawania bakterii, który mógłby zaburzyć tę równowagę, nie jest znany, ale fakt, że biologiczny „mechanizm” wydaje się istnieć w celu przywrócenia wahań populacji do poziomu równowagi, stanowi interesujący problem dla hipotezy o dozowaniu węgla; być może wyższy poziom bakterii nie może być utrzymany w autentycznym zbiorniku rafowym nawet po dozowaniu węgla, jeśli mechanizmy konsumpcji bakterii wzrosną w naturze. W tym scenariuszu miałby miejsce „eksport” składników odżywczych, przynajmniej częściowo, poprzez konsumpcję bakterii przez organizmy endogenne, a nie tylko poprzez fizyczne usuwanie z wody poprzez odpienianie białka; to znaczy, że niektóre składniki odżywcze pozostaną w systemie, choć na nowych poziomach troficznych. Ten problem wzrostu populacji bakterii w słupie wody poprzez dozowanie węgla w autentycznym, dobrze prosperującym zbiorniku rafowym można bezpośrednio zbadać, a wyniki tego eksperymentu opisano poniżej. Najpierw jednak jest jeszcze jedno pytanie na temat (nieumyślnego) dodawania bakterii poprzez podmiany wody, którym należy się zająć; czy bakterie pochodzą z samej mieszanki soli, czy też są wprowadzane przez (niesterylne) naczynie do mieszania? Ten problem wzrostu populacji bakterii w słupie wody poprzez dozowanie węgla w autentycznym, dobrze prosperującym zbiorniku rafowym można bezpośrednio zbadać, a wyniki tego eksperymentu opisano poniżej. Najpierw jednak jest jeszcze jedno pytanie na temat (nieumyślnego) dodawania bakterii poprzez podmiany wody, którym należy się zająć; czy bakterie pochodzą z samej mieszanki soli, czy też są wprowadzane przez (niesterylne) naczynie do mieszania? Ten problem wzrostu populacji bakterii w słupie wody poprzez dozowanie węgla w autentycznym, dobrze prosperującym zbiorniku rafowym można bezpośrednio zbadać, a wyniki tego eksperymentu opisano poniżej. Najpierw jednak jest jeszcze jedno pytanie na temat (nieumyślnego) dodawania bakterii poprzez podmiany wody, którym należy się zająć; czy bakterie pochodzą z samej mieszanki soli, czy też są wprowadzane przez (niesterylne) naczynie do mieszania?

Rysunek 15. Liczba bakterii/mL sześciu różnych marek mieszanki soli o zasoleniu do 35 ppt przy użyciu wody filtrowanej RO/DI/0,2 uM w zakręconych i owiniętych folią jałowych kolbach.

To pytanie zostało zbadane przez usunięcie pojemnika jako źródła skażenia bakteryjnego i/lub żywności. W szczególności, mieszanki słonej wody (do zasolenia 35 ppt) przygotowano z wody filtrowanej RO/DI/0.2 uM w sterylnych plastikowych kolbach Erlenmeyera (sterylna jednorazowa kolba PETG Nalgene 500 mL). Zbadano sześć mieszanek soli: Instant Ocean Reef Crystals (IORC), Instant Ocean (IO), Tropic Marin, Oceanic, Red Sea i Kent, a populację bakterii w każdej kolbie monitorowano przez 5 dni. Wszystkie kolby zamknięto i pokryto folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na standardowe oświetlenie fluorescencyjne w pomieszczeniu. Dołączono kolbę kontrolną zawierającą tylko filtrowaną wodę RO/DI/0,2 uM, a wyniki przedstawiono na ryc. 15.

Pięć z sześciu mieszanek soli (z wyjątkiem Morza Czerwonego) wykazywało niewielkie zanieczyszczenie bakteryjne poza kontrolą czystej wody, a populacje bakterii wahały się, ale nie rosły konsekwentnie w czasie, jak można by oczekiwać, gdyby dostępna była wystarczająca ilość składników odżywczych (por. Ryc. 13). Tak więc nie ma powodu, aby podejrzewać, że którakolwiek z tych pięciu mieszanek soli sama przyczynia się do wysokiego poziomu bakterii w słonej wodzie uzupełniającej z ryc. 13. Z drugiej strony, sól z Morza Czerwonego wydaje się nieść ze sobą nie bez znaczenia obciążenie bakteryjne. Po raz kolejny nastąpił niewielki wzrost w ciągu 5 dni, co wskazuje, że w tych „sterylnych” warunkach nie były dostępne składniki odżywcze wystarczające do wzrostu. Co jest takiego specjalnego w soli z Morza Czerwonego? Ta sól, jedyna spośród sześciu przetestowanych mieszanek, jest wytwarzana, przynajmniej częściowo, poprzez suszenie autentycznej wody morskiej. Zatem, wydaje się, że zatrzymuje niektóre żywe bakterie z procesu suszenia. Pozostałe pięć mieszanek soli jest przygotowywanych z mieszania ściśle chemicznych źródeł składników. Ogólnie rzecz biorąc, uzasadnione wydaje się stwierdzenie, że znaczące populacje bakterii w mieszanej wodzie morskiej są wynikiem zanieczyszczenia pojemnika, a nie samego wprowadzenia mieszanki solnej.

Ostatnie pytanie o zasadność testowania części „dodawania węgla” w hipotezie o dozowaniu węgla zostało wspomniane wcześniej; co dzieje się z czasem w autentycznej wodzie ze zbiornika rafowego po celowym dodaniu źródła węgla? Czy naturalne mechanizmy kontroli populacji bakterii poradzą sobie z indukowanym wzrostem populacji, tak aby utrzymać normalny poziom równowagi bakterii? A może te mechanizmy zostaną przeciążone i w związku z tym populacja bakterii wzrośnie? Aby zbadać ten kluczowy punkt, przyjęliśmy protokół dozowania węgla opisany przez Waltona i Bjornsona (Walton, 2008). W szczególności dodaliśmy czysty EtOH do 175-galonowego zbiornika rafowego KSF zgodnie z następującym harmonogramem:

Dzień 1-4: 0,28 ml (~0,17 ppm C w objętości zbiornika akwarium KSF)

Dzień 5-8: 0,58 ml (~ 0,35 ppm C)

Dzień 9-15: 0,78 ml (~ 0,47 ppm C)

Dzień 16-21: 0,98 ml (~ 0,60 ppm C)

Dzień 22-27: 1,18 ml (~ 0,71 ppm C)

Dzień 28-30: 1,38 ml (~ 0,84 ppm C)

Rysunek 16. Liczba bakterii/mL i [NO3] w zbiorniku rafowym KSF w ciągu 30 dni ze wzrostem dawki EtOH.

EtOH dodawano wczesnym rankiem, przed włączeniem światła i około 17 godzin po ostatnim karmieniu zbiornika. Próbki wody do analizy liczby bakterii pobrano tuż przed dodaniem EtOH. Przeprowadzono również okresowe pomiary [NO ₃ ] za pomocą zestawu Salifert. Podczas tego miesięcznego eksperymentu zbiornik utrzymywano w normalnych warunkach hodowlanych; cotygodniowa 30 galonów (17%) podmiana wody na słoną wodę IORC (odstawanie na 1 tydzień przed użyciem), co dwa tygodnie zmiana GAC i GFO, ciągłe odpienianie białka (H&S 200-1260), sterylizacja UV, cykl świetlny 8 godzin włączony/ 16 godzin wolnego. Wyniki tego eksperymentu ilustruje rys. 16.

Interpretacja tego eksperymentu jest nieco przyćmiona skomplikowaną historią. Ten eksperyment, jak opisano powyżej, miał trwać 30 dni. Niestety, po 20 dniach cytometr Coulter XL się zepsuł, a naprawa instrumentu zajęła kilka tygodni. Dane z trzech tygodni próbek zostały naruszone i cały eksperyment musiał zostać powtórzony. Akwarium o pojemności 175 galonów KSF utrzymywano jak opisano powyżej przez kolejne 2 miesiące bez dodatku EtOH przed ponownym rozpoczęciem eksperymentu z dawkowaniem, zgodnie z protokołem opisanym powyżej, a dane pokazane na Fig. 16 pochodziły z drugiego pełnego przebiegu.

Jednak między około 2 tygodniem początkowego eksperymentu z dodawaniem EtOH a rozpoczęciem ^drugiego eksperymentu EtOH około 9 tygodni później, zaobserwowano dwie istotne zmiany w akwarium KSF. Sinice pojawiły się niepożądanie po zniknięciu z akwarium KSF w wyniku zabiegu Chemiclean 6 miesięcy wcześniej. Sinice zbudowały znaczną powłokę na podłożu piaskowym i skale do czasu zakończenia drugiego eksperymentu z dodawaniem EtOH po 30 dniach. Ponadto cztery większe i stosunkowo stare Acroporakolonie koralowców rozwinęły białe „martwe” plamy w pobliżu ich podstaw, które stopniowo rozprzestrzeniały się w górę, ostatecznie pochłaniając koralowce. Nie można ustalić, czy ma tu miejsce przyczynowość, czy zbieg okoliczności. Jednak poziom bakterii w punkcie początkowym t = 0 dla drugiego schematu dawkowania EtOH, ~ 190 tys. bakterii/ml, jest znacznie wyższy niż populacja bakterii w stanie stacjonarnym w zbiorniku KSF mierzona w ciągu ostatnich 9 miesięcy (~70 – 100 tys. bakterie/ml). Kontrole ślepej próby wodnej i badanie próbki wody ze zbiornika PSU HUB (patrz Tabela 1) potwierdziły, że obecnie naprawiany cytometr Coulter XL nadal daje wiarygodne odczyty. Możliwe, że teraz wyższy punkt początkowy bakterii/ml odzwierciedla obecność dużej ilości sinic w słupie wody, nieobecnych we wszystkich wcześniejszych odczytach. Po zakończeniu 30-dniowego eksperymentu z dawkowaniem EtOH z Rys. 16, zbiornik KSF potraktowano Chemicleanem zgodnie ze wskazówkami na etykiecie w celu usunięcia sinic, a następnie przeprowadzono 90% podmianę wody (pięć 60-galonów (34%) podmiany wody 48 godz.). Dziesięć dni po zakończeniu tej wymiany wody liczba bakterii w zbiorniku KSF zarejestrowała się na poziomie 97000 ± 3000 bakterii/ml, dokładnie w tym samym miejscu, w którym była przed kampanią dozowania EtOH. ten dokładnie tam, gdzie było przed kampanią dozowania EtOH. ten dokładnie tam, gdzie było przed kampanią dozowania EtOH. tenPorażone koralowce niestety nie wyzdrowiały, ale odłamki odcięte z żywych gałęzi później dobrze się rozwijały.

Niemniej jednak, nawet biorąc pod uwagę podwyższoną początkową liczbę bakterii, jasne jest, że mierzalna populacja bakterii w kolumnie wody 175-galonowego akwarium KSF nie uległa gwałtownemu wzrostowi po dozowaniu EtOH, co zaobserwowano w przypadku usuniętych 30-galonowych próbek wody, ryc. . 10 i 11. Ponadto nie stwierdzono wykrywalnego trendu w [NO ₃] poziomy; wartość oscylowała wokół poziomu przepustowości 2-5 ppm. Obserwacja populacji bakterii przypomina, że wykryta liczba bakterii/ml rzeczywiście odzwierciedla dynamiczną równowagę między wprowadzeniem bakterii (głównie przez wzrost) a usunięciem bakterii przez śmierć/drapieżnictwo. W przypadku próbek wody o pojemności 30 galonów wyjętych ze zbiornika i umieszczonych w wannie Rubbermaid, rozsądne wydaje się założenie, że ponieważ osiadłe podajniki filtrujące (= bezpośredni konsumenci bakterii lub konsumenci organizmów konsumujących bakterie; tj. „ drapieżniki”) nie były już obecne, zaobserwowana populacja bakterii wzrosła dramatycznie po dodaniu źródła paliwa. Jednak w 175-galonowym zbiorniku rafowym z ryc. 16 konsumenci bakterii są nadal obecni, i w rzeczywistości mogą reagować na wzrost populacji bakterii napędzanych EtOH, zwiększając również ich własną liczbę. Najbardziej bezpośredni konsumenci bakterii, większa mikrofauna w słupie wody, mogą zatem również doświadczyć wzrostu populacji, chociaż nasza metoda badania wody nie wykazałaby tego wzrostu. Ostatecznie to paliwo węglowe (= EtOH) może przedostać się w górę łańcucha pokarmowego, aż osiadłe filtry w zbiorniku (koralowce, gąbki, robaki itp.) zużyją je, usuwając w ten sposób z kolumny wody (ale nie ze zbiornika !). Tak więc spekulujemy, że populacja bakterii może nie wykazywać dowodów na wzrost po dawkowaniu EtOH, ponieważ każdy wzrost jest równoważony przez odpowiedni wzrost usuwania przez drapieżniki. Niektóre z tych większych mikrofauny słupa wody zostaną usunięte przez szumowanie*, iw ten sposób realizowany będzie ogólny plan eksportu składników odżywczych. Jednak część wprowadzonego składnika odżywczego zawierającego węgiel prawdopodobnie zostanie zatrzymana w filtrze osiadłym karmiącym zwierzęta gospodarskie, a zatem pozostanie w całym ekosystemie zbiornika. Przypuszczalnie tak długo, jak ci końcowi konsumenci żyją i rozwijają się w wyniku dodanych składników odżywczych zawierających węgiel, nie stanowią bezpośredniego zagrożenia przyczyniania się do poziomu składników odżywczych w odpadach w akwarium.

* W niepublikowanych wynikach, badanie odtłuszczonego z 175 galonowego akwarium KSF, usuniętego przez odpieniacz H&S 200, za pomocą mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości, wykazało obecność wielu przykładów mikrofauny z rodzin okrzemek i otwornic. Jest prawdopodobne, że członkowie tych rodzin, przynajmniej w obrębie otwornic, odpowiadają za drapieżnictwo bakteryjne. Dziękujemy Jamiemu Kunkle z Pennsylvania State University Materials Research Lab za udostępnienie tych zdjęć.

Ogólnie rzecz biorąc, główne wnioski z tych eksperymentów z dawkowaniem węgla są następujące:

Dodanie źródła węgla (EtOH lub niescharakteryzowana organiczna „masa”) do wody ze zbiornika rafowego usuniętej ze środowiska rafy prowadzi do dramatycznego wzrostu obciążenia bakteriami w słupie wody.
Dodanie źródła węgla (EtOH) do aktywnego zbiornika rafowego zgodnie z zalecanym harmonogramem nie prowadzi do żadnego mierzalnego wzrostu obciążenia bakteriami w słupie wody.
Świeża jednodniowa słona woda przygotowana w niesterylnym środowisku ma ładunek bakterii około 10 razy większy niż odtłuszczona woda ze zbiornika rafowego.

3.3 Usuwanie bakterii przez filtrację mechaniczną – jak skuteczne?

Trzeci i ostatni temat badawczy pod ogólnym hasłem modulowania populacji bakterii w wodzie akwariowej skupia się na kwestii mechanicznego eksportu bakterii, niezbędnego wymogu dla nadrzędnego celu, jakim jest wyczerpanie składników odżywczych w oparciu o dawkowanie węgla. Widzieliśmy już poszlakowe dowody na usuwanie bakterii z słupa wody przez drapieżniki, ale proces ten nie usuwa zawartości składników odżywczych bakterii z zamkniętego systemu akwariów. Do tej funkcji wymagany jest pewien rodzaj filtracji mechanicznej, który jest przeznaczony specjalnie do usuwania bakterii. Hipoteza dozowania węgla przytacza szumowanie białek jako mechanizm fizycznego usuwania bakterii, wraz z ich ładunkiem odżywczym, z wody akwariowej. Zwróć uwagę, że szumowanie lub jakikolwiek rodzaj filtracji mechanicznej może usunąć tylko bakterie znajdujące się w słupie wody; Biofilmy bakteryjne na powierzchniach można usunąć tylko wtedy, gdy zostaną usunięte i dostaną się do słupa wody. Dlatego postanowiliśmy zbadać zdolność odpieniacza białek, w naszym przypadku Bubble King mini 160, do szorowania autentycznej wody akwariowej z jej ładunku bakteryjnego. W literaturze istnieją doniesienia (Brambilla, 2008; Suzuki, 2008), które dokumentują zdolność frakcjonowania piany (= szumiące białka) do usuwania bakterii zarówno z przybrzeżnej wody morskiej, jak i systemu hodowli ryb z zamkniętym obiegiem. W pierwszym przypadku (Suzuki, 2008) próbka przybrzeżnej wody morskiej z portu rybackiego w pobliżu Miyazaki w Japonii była stale odtłuszczana za pomocą odpieniacza białkowego DYI, a usuwanie różnych rodzajów bakterii z kolumny wody, zgłaszane jako skuteczność usuwania (100% = całkowite usunięcie bakterii) następuje:Enterokoki , Vibrio i Salmonella , 55-60%; Coli w kale, 5%. Wydaje się zatem, że nie wszystkie rodzaje bakterii reagują identycznie na ekstrakcję pęcherzykową. Ten ostatni eksperyment (Brambilla, 2008) udokumentował, że w zamkniętym, recyrkulacyjnym systemie składającym się tylko z ryb, populacje bakterii w słupie wody można zmniejszyć z 32-88% przez szumowanie, w zależności od szczegółów eksperymentu. Zinterpretowaliśmy te dwa niezależne zestawy wyników jako stanowiące silny precedens dla przewidywania, że będziemy obserwowali podobne zachowanie podczas szumowania wody w akwarium. Oprócz odpieniania białek, wielu akwarystów wykorzystuje granulowany węgiel aktywny (GAC) jako aktywne medium filtracyjne do usuwania TOC z akwariumwody, więc zastanawialiśmy się, czy GAC może również przyczynić się do mechanicznego usuwania bakterii z wody akwariowej.

Kwestia remediacji wody bakteryjnej na bazie GAC została zbadana poprzez usunięcie 5 galonów wody ze zbiornika KSF, która została przygotowana w następujący sposób; Odpieniacz H&S 200 w zbiorniku KSF został wyłączony na 42 godziny przed usunięciem wody, 17% (30 galonów) podmianę wody na słoną wodę IORC przeprowadzono 24 godziny przed usunięciem wody, a zbiornik podano 3,5 godziny przed usunięciem wody. Ta próbka wody o pojemności 5 galonów została umieszczona w plastikowym pojemniku i, pamiętając o szybkim wzroście populacji bakterii w niesterylnych plastikowych pojemnikach, próbka została natychmiast poddana recyrkulacji przez reaktor Phosban zawierający 150 g HC2 GAC. Przed uruchomieniem pompy reaktora Phosban, pięć 25 ml próbek wody pobrano z 5-galonowego wiadra i umieszczono w sterylnych probówkach wirówkowych, zamknięto i odstawiono na bok. Te pięć probówek służy jako kontrola wzrostu bakterii; w 30-minutowych odstępach czasu podczas przebiegu GAC do każdej probówki dodano kolejno 0,5 ml 37% roztworu formaldehydu i te probówki kontrolne natychmiast zamrożono w oczekiwaniu na późniejszą analizę. Probówki te nie są doskonałą kontrolą, ponieważ nie uwzględniają wzrostu bakterii wywołanego przez plastikowe pojemniki, ale służą jako kontrola pod kątem ogólnego zanieczyszczenia. Próbki (25 ml, poddane obróbce z formaldehydem, jak opisano w Ogólnym Eksperymencie) okresowo usuwano z objętości 5 galonów podczas przebiegu GAC. Wybrano cały eksperymentalny okres 120 minut, aby zminimalizować możliwość rozwoju bakterii napędzanych plastikowymi pojemnikami, co może maskować wykrycie jakiegokolwiek zubożenia wywołanego przez GAC. i te probówki kontrolne zostały natychmiast zamrożone w oczekiwaniu na późniejszą analizę. Probówki te nie są doskonałą kontrolą, ponieważ nie uwzględniają wzrostu bakterii wywołanego przez plastikowe pojemniki, ale służą jako kontrola pod kątem ogólnego zanieczyszczenia. Próbki (25 ml, poddane obróbce z formaldehydem, jak opisano w Ogólnym Eksperymencie) okresowo usuwano z objętości 5 galonów podczas przebiegu GAC. Wybrano cały eksperymentalny okres 120 minut, aby zminimalizować możliwość rozwoju bakterii napędzanych plastikowymi pojemnikami, co może maskować wykrycie jakiegokolwiek zubożenia wywołanego GAC. i te probówki kontrolne zostały natychmiast zamrożone w oczekiwaniu na późniejszą analizę. Probówki te nie są doskonałą kontrolą, ponieważ nie uwzględniają wzrostu bakterii wywołanego przez plastikowe pojemniki, ale służą jako kontrola pod kątem ogólnego zanieczyszczenia. Próbki (25 ml, poddane obróbce z formaldehydem, jak opisano w Ogólnym Eksperymencie) okresowo usuwano z objętości 5 galonów podczas przebiegu GAC. Wybrano cały eksperymentalny okres 120 minut, aby zminimalizować możliwość rozwoju bakterii napędzanych plastikowymi pojemnikami, co może maskować wykrycie jakiegokolwiek zubożenia wywołanego przez GAC. poddane obróbce z formaldehydem, jak opisano w Ogólnym Eksperymencie) okresowo usuwano z objętości 5 galonów podczas przebiegu GAC. Wybrano cały eksperymentalny okres 120 minut, aby zminimalizować możliwość rozwoju bakterii napędzanych plastikowymi pojemnikami, co może maskować wykrycie jakiegokolwiek zubożenia wywołanego GAC. poddane obróbce z formaldehydem, jak opisano w Ogólnym Eksperymencie) okresowo usuwano z objętości 5 galonów podczas przebiegu GAC. Wybrano cały eksperymentalny okres 120 minut, aby zminimalizować możliwość rozwoju bakterii napędzanych plastikowymi pojemnikami, co może maskować wykrycie jakiegokolwiek zubożenia wywołanego przez GAC.

Rysunek 17. Liczba bakterii/mL w próbce wody ze zbiornika KSF o pojemności 5 galonów, która została poddana filtracji przy użyciu 150 g granulowanego węgla aktywnego HC2 w reaktorze Phosban. Próbkę wody usunięto ze zbiornika KSF 48 godzin po wyłączeniu odpieniacza zbiornika KSF, 24 godziny po 17% podmianie wody i 3,5 godziny po zasileniu zbiornika.

Dane przedstawiono na ryc. 17. Oczywiście nie ma dowodów na poparcie tezy, że filtracja GAC może służyć jako skuteczna metoda usuwania bakterii z słupa wody. Zamiast spadać, poziom bakterii w próbce wody nieznacznie wzrasta (~1,4x w porównaniu z punktem początkowym), a następnie spada. To zachowanie nie różni się od tego, czego można by się spodziewać, gdyby ładunek organiczny na powierzchni pojemnika napędzał rozwój niektórych bakterii, przynajmniej do czasu zużycia źródła węgla. Próbki kontrolne również nieznacznie wzrosły (1,3x) w tym samym 2-godzinnym okresie, co przypomina, że niewielki wzrost bakterii jest prawie nieunikniony w próbkach wody stojącej. Tak więc GAC nie wydaje się być skuteczną metodą usuwania bakterii z słupa wody zbiorników rafowych.

Następnie skupiliśmy się na większej kwestii wyczerpywania się bakterii w zbiorniku rafowym na bazie skimmerów. Podobnie jak w eksperymencie GAC, najpierw „przygotowaliśmy” próbkę wody ze zbiornika KSF poprzez (a) wyłączenie odpieniacza zbiornika i filtra GAC na 42 godziny przed usunięciem wody oraz (b) zasilenie zbiornika 3,5 godziny przed usunięciem wody. W tym przypadku zwykłą próbkę wody o pojemności 30 galonów usunięto ze zbiornika KSF i umieszczono w wannie Rubbermaid zawierającej odpieniacz proteinowy Bubble King mini 160; obieg wody zapewniały dwie głowice. Natychmiast pobrano pięć próbek wody kontrolnej o objętości 25 ml i odstawiono na bok; do tych probówek kontrolnych dozowano kolejno 0,5 ml 37% roztworu formaldehydu w 30-minutowych odstępach czasu podczas przebiegu skimmera i zamrożono do późniejszej analizy, jak opisano powyżej. Odpieniacz został włączony, a rurę wznośną wyregulowano w celu utrzymania wysokości piany w granicach zalecanych przez producenta. Próbki wody o objętości 25 ml pobierano okresowo w ciągu 120 minut i przetwarzano w sposób opisany powyżej. Dane wynikające z tego badania przedstawiono na ryc. 18.

Rysunek 18. Liczba bakterii/ml w 30 galonowej próbce wody pobranej ze zbiornika KSF i poddanej natychmiastowemu odpienianiu za pomocą odpieniacza proteinowego Bubble King mini 160. Próbka wody została wyjęta z akwarium KSF ~ 3,5 godziny po nakarmieniu zbiornika; Odpieniacz H&S 200 i filtr GAC zbiornika KSF były wyłączone na 42 godziny przed usunięciem wody. W trakcie eksperymentu wanna Rubbermaid była luźno przykryta folią aluminiową.

Kontrola tych danych ujawnia, że podobnie jak w eksperymencie GAC, nie ma dowodów sugerujących, że ten odpieniacz był w stanie usunąć bakterie z tej próbki wody w ciągu 2 godzin trwania eksperymentu. Zarówno próbki wody odtłuszczonej (różowe), jak i próbki kontrolne (aqua) wahają się pod względem wartości bakterii/mL w dość wąskim zakresie (75 – 90K/mL) bez pojawienia się żadnego znaczącego trendu. Ponieważ próbka wody odtłuszczonej wykazywała takie samo zachowanie jak kontrolne próbki wody nie odtłuszczonej, nie jest możliwe wyciągnięcie dalszych wniosków z tego eksperymentu. Wyniki te były dość niepokojące; dlaczego odpieniacz nie pozbawił wody akwariowej przynajmniej części jej ładunku bakteryjnego? Czy to problem ze skimmerem, czy problem z bakteriami?

Jednym ze sposobów zbadania tego zagadkowego punktu jest użycie wody akwariowej, która została „sztucznie” wzbogacona bakteriami; być może przy znacznie większym obciążeniu bakteriami odpieniacz będzie działał zgodnie z oczekiwaniami. W tym celu skorzystaliśmy z wcześniejszej obserwacji, że pozostawienie wody w akwarium na kilka dni w plastikowym pojemniku prowadzi do dramatycznego wzrostu populacji bakterii w wodzie. Pobraliśmy próbkę wody ze zbiornika KSF o pojemności 30 galonów, przygotowaną zgodnie z wcześniejszym opisem, i umieściliśmy ją w odkrytej wannie Rubbermaid z obecnym, ale wyłączonym odpieniaczem, i dwoma głowicami napędowymi włączonymi do cyrkulacji. Po 5 dniach wannę przykryto folią, odpieniacz włączono, a eksperyment odpieniacza prowadzono przez 120 minut. Ponadto zwykłe próbki kontrolne zostały usunięte na początku przebiegu skimmera. W tym przypadku,

Rysunek 19. Liczba bakterii/ml w 30 galonowej próbce wody pobranej ze zbiornika KSF i trzymanej w wannie Rubbermaid przez pięć dni przed poddaniem jej odpienianiu za pomocą odpieniacza białek Bubble King mini 160. Próbka wody została wyjęta z akwarium KSF ~ 3,5 godziny po nakarmieniu zbiornika; Odpieniacz H&S 200 i filtr GAC zbiornika KSF były wyłączone na 42 godziny przed usunięciem wody. Próbka wody w wannie Rubbermaid została wystawiona na fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia przez 5-dniowy okres osadzania, ale luźno przykryta folią aluminiową przez cały cykl skimmera.

To doświadczenie pokazuje, że odpieniacz Bubble King mini 160 skutecznie usuwa bakterie ze zmodyfikowanej próbki wody akwariowej, co najmniej w zakresie około 39% w ciągu 2 godzin. Próbki kontrolne wody pozostały dość stałe w porównaniu. Tak więc po raz pierwszy możemy stwierdzić, że szumowanie usuwa niektóre bakterie z kolumny wody w zbiorniku rafowym. Jednak sztuczna natura tego eksperymentu, z indukowaną wysoką populacją bakterii, rodzi ważne pytanie o jego znaczenie dla usuwania bakterii z nieoczyszczonej próbki wody ze zbiornika rafowego. Niemniej jednak wykazano, że mechanizm szumowania białek oparty na bąbelkach sam w sobie jest zdolny do eksportu bakterii, a zatem element układanki z rys. 18 jest uniewinniony.

Jak możemy zaprojektować eksperyment, który bada kwestię eksportu bakterii na bazie skimmera w bardziej realistycznym otoczeniu przypominającym zbiornik rafowy? Jedną z możliwości jest poleganie na naszym schemacie dozowania EtOH, aby zapewnić niezbędną „bogate w bakterie”, ale poza tym realistyczną próbkę wody akwariowej. Pomysł ten został zrealizowany przez pobranie próbki wody o pojemności 30 galonów ze zbiornika KSF, przygotowanej w sposób opisany powyżej, i umieszczenie jej w wannie Rubbermaid z cyrkulacją zapewnianą przez dwie głowice napędowe. Odpieniacz Bubble King był w wodzie, ale nie działał. EtOH (0,29 ml, ~ 1 ppm C) dodawano codziennie przez trzy dni. Po upływie 3 dni odpieniacz został aktywowany, a próbki wody pobrano i poddano obróbce, jak opisano wcześniej. Ponadto poziomy TOC tej próbki wody były monitorowane podczas 120-minutowego biegu szumów. Wyniki przedstawiono na rys. 20.

Rysunek 20. Liczba bakterii/ml i poziomy TOC w 30 galonowej próbce wody pobranej ze zbiornika KSF, trzymanej w wannie Rubbermaid przez trzy dni z codziennym dawkowaniem 0,29 ml EtOH (~ 1 ppm C), a następnie poddanej odpienianiu za pomocą odpieniacz białek Bubble King mini 160. Próbka wody została wyjęta z akwarium KSF ~ 3,5 godziny po nakarmieniu zbiornika; Odpieniacz H&S 200 i filtr GAC zbiornika KSF były wyłączone na 42 godziny przed usunięciem wody. Próbka wody w wannie Rubbermaid została wystawiona na fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia przez 3-dniowy okres dozowania EtOH, ale luźno przykryta folią aluminiową przez cały cykl skimmera.

Początkowa populacja bakterii w tym przypadku, ~ 2300K/ml, była niższa niż ta generowana przez zwykłe użycie samej wanny (lub jej organicznej powłoki powierzchniowej) jako źródła składników odżywczych dla wzrostu bakterii (por. Ryc. 19). Powód tej różnicy nie jest jasny. Niemniej jednak, profil zubożenia bakterii wygenerowany w tym eksperymencie (różowa linia na ryc. 20) jest dość podobny do tego obserwowanego w eksperymencie z ryc. 19, chociaż ogólny % spadek populacji bakterii jest nieco mniejszy (28% w porównaniu z 39% na rys. 19). Nie odtłuszczona próbka wody kontrolnej pozostawała względnie stała w populacji bakterii w ciągu 2 godzin trwania tego eksperymentu. Poziom TOC w próbce wody jest również zmniejszany przez szumowanie, spadając z około 2,5 ppm do około 2,0 ppm (spadek ~ 25%) w ciągu 2 godzin pracy odpieniacza. Wydaje się, że zarówno populacja bakterii, jak i poziom TOC osiągnęły swoje „podłogi”; nie wykryto dalszego usuwania każdego z nich w ostatniej trzeciej części przebiegu. Po raz kolejny potwierdziliśmy, że jeśli próbka wody w akwarium jest „zaszczepiona” bakteriami, obserwuje się usuwanie za pomocą skimmera. Jednak wyniki obu tych eksperymentów (ryc. 19 i 20) wskazują, że tylko składnik całej kohorty bakterii słupa wody wydaje się być podatny na usuwanie za pomocą skimmera.

Podjęto ostatnią próbę wykrycia usuwania bakterii za pomocą skimmera z niezbyt zaburzonej wody akwariowej KSF, Rys. 21. Obserwacja (Rys. 14), że woda podmiana IORC wprowadza do akwarium niektóre bakterie, służyła jako katalizator dla tego ostatniego biegu skimmera. W tym przypadku odpieniacz H&S i filtr GAC zostały wyłączone 48 godzin przed usunięciem wody. Następnie przeprowadzono dwie 30-galonowe podmiany wody przez dwa kolejne dni tuż przed pobraniem doświadczalnej próbki wody. W związku z tym populacja bakterii w wodzie akwariowej powinna być podwyższona w stosunku do jej poziomu równowagi (i nie do odtłuszczenia), ale nie do sztucznie zawyżonej wartości, jak w przypadku dozowania EtOH (ryc. 20) lub zanieczyszczenia wanny (ryc. 19). Ta próbka wody została zebrana natychmiast po przeniesieniu do wanny Rubbermaid. Jak się okazało, początkowy poziom populacji bakterii nie był szczególnie wysoki, około 90K/mL. W ciągu pierwszych 10 minut pracy odpieniacza wartość ta wzrosła do około 100K/mL, prawdopodobnie w wyniku dodanych bakterii z konfiguracji wanny/skimera/głowicy. Pomimo tego początkowego zaskakującego punktu danych, pozostałe dane zebrane w ciągu następnych 110 minut miały oczekiwany przebieg, a poziom bakterii zmniejszył się ogólnie o około 29%. Nie odtłuszczona próbka wody kontrolnej nie wykazywała żadnych znaczących wahań zawartości bakterii w trakcie eksperymentu. Po raz pierwszy uzyskaliśmy dowody na to, że szumowanie białek wyczerpuje niektóre bakterie z autentycznej wody akwariowej, której poziom bakterii/ml nie jest tak bardzo odbiegający od nienaruszonego systemu (por. Tabela 1). Niemniej jednak, jedna wiadomość płynie wyraźnie ze wszystkich tych eksperymentów, niezależnie od początkowego poziomu bakterii/ml; tylko niewielka część (~28 – 39%) obecnych bakterii jest podatna na ekstrakcję pęcherzykami.

Rysunek 21. Liczba bakterii/ml w 30 galonowej próbce wody pobranej ze zbiornika KSF i poddanej odpienianiu za pomocą odpieniacza proteinowego Bubble King mini 160. Zbiornik KSF został poddany dwóm 30-galonowym podmianom wody przy użyciu słonej wody IORC (6 dni w pojemniku na wodę i 1 dzień w pojemniku na wodę) przez dwa kolejne dni przed pobraniem próbki wody. Próbka wody została wyjęta z akwarium KSF ~ 3,5 godziny po nakarmieniu zbiornika; Odpieniacz H&S 200 i filtr GAC w zbiorniku KSF były wyłączone na 48 godzin przed usunięciem wody. Próbka wody w wannie Rubbermaid była luźno przykryta folią aluminiową przez cały czas pracy skimmera.

Na koniec zastanawialiśmy się, jak wyniki szumowania z tymi „przechwyconymi” próbkami wody, tj. Próbkami usuniętymi z autentycznej rafy, a tym samym pozbawionymi wszystkich dynamicznych mechanizmów wzrostu/usuwania bakterii obecnych w zbiorniku rafowym, mogą się porównać z wynikami uzyskanymi po szumiąc faktycznie funkcjonujący zbiornik rafowy. Oczywiście taki zbiornik nie może być wstępnie odtłuszczony lub wrócimy do miejsca, w którym zaczęliśmy od Rys. 18. Zbiornik SJ 55 galonów spełnia to wymaganie (patrz Rys. 6); ma zdrową, kwitnącą populację ryb, miękkich koralowców , bezkręgowców itp., ale ten zbiornik nie był odtłuszczany ani traktowany filtracją GAC przez około sześć miesięcy. Został on jednak poddany codziennemu dodawaniu wódki, jak opisano w dyskusji w tabeli 1 i ryc. 9. Odpieniacz proteinowy Bubble King mini 160został umieszczony w studzience tego systemu akwariowego, włączony i wyregulowany jak opisano powyżej. Próbki wody (25 ml) usuwano okresowo w ciągu 24 godzin, dozowano 0,5 ml 37% formaldehydu i zamrażano do późniejszej analizy. W tym eksperymencie nie zastosowano żadnych próbek kontrolnych. Wyniki przedstawiono na ryc. 22.

Najwyraźniej odpieniacz Bubble King skutecznie zmniejszył obciążenie bakteriami tej naturalnie bogatej w bakterie wody w zbiorniku o około 37%. W rzeczywistości spadek ten został odnotowany po 8 godzinach, a nawet po 2 godzinach (okres eksperymentów z szumowaniem wody w zbiorniku KSF) spadek populacji bakterii był znaczący; ~ 22%. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano późnego wzrostu populacji bakterii; odpieniacz skutecznie utrzymywał poziom na pewnej wartości bazowej (~ 1500 K/mL) dla tego zbiornika. Co ciekawe, nawet uważano, że populacja bakterii, która zaczynała w eksperymentach z filtrowaniem wody w zbiorniku KSF (ryc. 19, 20 i 21) oraz w eksperymencie z filtrowaniem SJ 55 była bardzo różna, we wszystkich przypadkach tylko około 28-39% pierwotnych bakterii zostały usunięte, zanim dane zostały „spłaszczone”.

Rycina 22. Liczba bakterii/ml w słupie wody w 55-galonowym, kwitnącym zbiorniku rafowym podczas odpieniania za pomocą odpieniacza proteinowego Bubble King mini 160. Ten zbiornik był codziennie przez 6 miesięcy traktowany EtOH, ale nie zawiera ani skimmera, ani filtra GAC.

Jest to prawdopodobnie znacząca obserwacja, że w populacji bakterii w wodzie akwariowej znajduje się podłoże, którego szumowanie nie naruszy. Być może w obu źródłach wody, naiwnej wodzie w zbiorniku SJ 55 i zmodyfikowanej (lub nie) KSF, wydaje się, że istnieją dwie funkcjonalnie różne populacje bakterii; jeden, który jest podatny na usuwanie pęcherzyków i taki, który nie jest. Na czym polega ta różnica funkcjonalna, jeśli chodzi o skimmer? Wcześniejsza publikacja opisuje ograniczenia mechanizmów bąbelkowych w szorowaniu TOC z wody akwariowej (Feldman, 2009). Argument wysunięty w tym przypadku może równie dobrze mieć zastosowanie tutaj, ryc. 23. Jest prawdopodobne, że wymóg hydrofobowych łat na cząstkach (tj. bakteriach, cząsteczkach TOC lub klastrach; patrz ładunek powierzchniowy bakterii i szumowanie białek, rozdział1.2 powyżej), które muszą być spełnione, aby ekstrakcja na bazie bąbelków zakończyła się sukcesem, może dotyczyć tylko niektórych, ale nie wszystkich bakterii z kolumny wody w akwarium (około 28-39%, według naszych badań). W związku z tym może wystąpić pewne rozróżnienie przez odpieniacz na podstawie właściwości powierzchni bakterii. Ponadto niektóre, ale nie wszystkie bakterie tworzą wielokomórkowe grudki (kłaczki), które mogą być podatne na ekstrakcję w oparciu o pianę, opartą na prostej wyporności, a nie na chemii powierzchni pęcherzyków; po raz kolejny ten fizyczny proces stanowi podstawę do wyboru pomiędzy różnymi typami bakterii. Tak więc wydaje się, że niektóre, ale nie wszystkie bakterie można usunąć przez szumowanie białek .

Rysunek 23. Spekulacje na temat tego, dlaczego tylko niektóre, ale nie wszystkie bakterie obecne w wodzie akwariów rafowych są usuwane przez szumowanie białek (na podstawie Feldman, 2009).

Ogólnie rzecz biorąc, główne wnioski z tych eksperymentów usuwania bakterii z kolumny wody są następujące:

Filtracja GAC (ziarnisty węgiel aktywny) nie usuwa bakterii z słupa wody.
Odpienianie białka (pęcherzyki) usuwa około 30-40% bakterii w słupie wody oczyszczonej węglem lub wody bogatej w substancje organiczne, ale pozostała część nie jest podatna na usuwanie pęcherzyków.
Populacje bakterii w stanie stacjonarnym w odtłuszczonej wodzie ze zbiornika rafowego nie podlegają dalszemu usuwaniu bakterii z odpieniacza - istnieje wartość bazowa, której odpieniacz nie spadnie poniżej.

4. Wnioski

Wstępne badania opisane w niniejszym dokumencie po raz pierwszy dokumentują modulację populacji bakterii słupowych wody w wodzie ze zbiorników rafowych w wyniku (a) dodania źródła węgla lub (b) filtracji mechanicznej (GAC, szumowanie). Informacje te odnoszą się do hipotezy dozowania węgla w usuwaniu składników odżywczych w akwariach morskich.

W akwariach poddanych aktywnej filtracji poprzez szumowanie występują populacje bakterii słupowych, które stanowią około 1/10 tych obserwowanych na naturalnych rafach. Konsekwencje tej dysproporcji dla długoterminowego zdrowia zwierząt hodowlanych w zbiorniku nie są znane. W jaki sposób organizmy z akwarium rafowego przystosowują się do tak ubogiego w bakterie środowiska? Czy cała sieć pokarmowa w akwarium jest zaburzona, czy też istnieją mechanizmy kompensacyjne, które utrzymują odpowiednią transdukcję energii na wszystkich poziomach troficznych? Czy „syndrom starego zbiornika” jest związany z możliwymi niedoborami żywieniowymi wynikającymi z tej „luki” bakteryjnej? Alternatywnie, czy „syndrom starego zbiornika” może być objawem stopniowego zmniejszania różnorodności bakterii w wyniku selektywnego usuwania za pomocą skimmera tylko bakterii podatnych na pęcherzyki? Obecnie,

Z drugiej strony, nasze badania wykazały, że wzrost bakterii wydaje się być ograniczony węglem w wodzie akwariowej rafy. Istnieje jednak wyraźna różnica między wodą ze zbiornika rafowego w aktywnym zbiorniku rafowym a wodą ze zbiornika rafowego usuniętą ze zbiornika. W tym drugim przypadku konsumenci bakterii są w dużej mierze nieobecni, a więc napędzanie wzrostu bakterii poprzez dodanie węgla przekłada się na szybki i duży wzrost populacji bakterii. Jednak w aktywnym zbiorniku rafowym wzrost populacji nie jest widoczny, prawdopodobnie dlatego, że aktywne drapieżniki utrzymują ogólny poziom w ryzach. Badania te podkreślają zatem wysoce dynamiczny charakter populacji bakterii w słupie wody akwariów rafowych. Z innej perspektywy

Wreszcie, filtracja mechaniczna w formie szumowania, ale nie GAC, zapewnia skuteczny sposób eksportu bakterii, przynajmniej do pewnego momentu. Wydaje się prawdopodobne, że niektóre rodzaje bakterii są rzeczywiście „skażone”, ale inne nie. W ten sposób szumowanie nieumyślnie zapewnia poważną (?) presję ewolucyjną, aby wypaczyć populację bakterii zamieszkujących słup wody w zbiorniku, aby faworyzować kohortę „niepodlegającą szumowieniu”.

Konkluzja w odniesieniu do hipotezy o dozowaniu węgla jest jasna; wydaje się, że podstawowe założenia tej teorii wytrzymują eksperymentalną analizę; dozowanie węgla zwiększa populację bakterii w słupie wody, a szumowanie usuwa niektóre bakterie wraz z towarzyszącymi im ładunkami składników odżywczych. Zatem nauka leżąca u podstaw tego podejścia do eksportu składników odżywczych wydaje się słuszna.

5. Podziękowania

Dziękujemy Eberly College of Science na Pennsylvania State University oraz E. I DuPont de Nemours and Co. za wsparcie finansowe. Z wdzięcznością doceniamy fachową wiedzę i pomoc dr Elaine Kunze, Susan Magaree i Nicole Zembower z laboratorium cytometrii przepływowej w Huck Institutes of the Life Sciences w stanie Penn. Ponadto dziękujemy panu Davidowi Jonesowi z Wydziału Inżynierii Lądowej i Środowiskowej Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii za pomoc przy korzystaniu z analizatora Shimadzu 5000 TOC.

6. Referencje

Ainsworth, TD; Dobra, M.; Roff, G.; Hoegh-Guldberg, O. 2008. „Bakterie nie są główną przyczyną bielenia śródziemnomorskich koralowców Oculina patagonia ”. ISME J. (Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology), 2, 67-73.
Azam, F.; Malfatti, F. 2007. „Strukturyzacja mikrobiologiczna ekosystemów morskich”. Nature Rev. Microbiol., 5, 782-791.
Bergey, DH 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed. (Pod redakcją Johna G. Holta i in.) Baltimore: Williams & Wilkins.
Brambilla, F.; Antonini, M.; Ceccuzzi, P.; Terova, G.; Saroglia, M. 2008. „Wydajność frakcjonowania piany w usuwaniu cząstek stałych i bakterii heterotroficznych z systemu recyrkulacji labraksa ( Dicentrarchus labrax )”. Inżynieria akwakultury, 39, 37-42.
Brettar, I.; Rheinheimer, G. 1992. „Wpływ dostępności węgla na denitryfikację w środkowej części Morza Bałtyckiego”. Limnol. Oceanogr., 37, 1146-1163.
Bretz, HW; Wang SL; Grieves, RB 1966. „Zmienne wpływające na separację piany Escherichia coli. ” Zał. Microbiol., 14, 778-783.
przycisk, Dania; Robertson, BR 1989. „Kinetyka procesu bakteryjnego w naturalnych systemach wodnych opartych na biomasie, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej o wysokiej rozdzielczości”. Cytometria, 10, 558-563.
Kano, RJ; Borucki, M., 1995. „Odrodzenie i identyfikacja zarodników bakteryjnych w bursztynie dominikańskim sprzed 25 do 40 milionów lat”. Nauka, 268, 1060-1064.
Carlson, Kalifornia; Ducklow, HW 1996. „Wzrost bakterioplanktonu i zużycie rozpuszczonego węgla organicznego w Morzu Sargassowym”. Aq. Ek. mikrobiologiczna, 10, 69-85.
Carrero-Colon, M.; Nakatsu, CH; Konopka, A. 2006. „Wpływ okresowości składników odżywczych na dynamikę społeczności drobnoustrojów”. Zał. Otaczać. Mikrobiol. 72, 3175-3185.
Dinsdale, EA; Pantos, O.; Smriga, S.; Edwardsa, RA; Angly, F.; Wegley, L.; Hatay, M.; Hall, D.; Brązowy, E.; Haynes, M.; Krause, L.; Sala, E.; Sandin, SA; Thurber, RV; Willis, BL; Azam, F.; Knowlton, N.; Rohwer, F. 2008. „Ekologia mikrobiologiczna czterech atoli koralowych na Wyspach Linii Północnej”. PLoS jeden, 3, e1584, 1-17.
Kaczka, HW; Mitchell, R. 1979. „Populacje i adaptacje bakterii w warstwach śluzu na żywych koralowcach”. Limnol. Oceanogr., 24, 715-725.
Ducklow, HW 1983. „Produkcja i los bakterii w oceanach”. BioScience, 33, 494-501.
Eppley, RW 1980. „Szacowanie tempa wzrostu fitoplanktonu w centralnych oceanach oligotroficznych”. Symp. Biol., 31, 231-242.
Feldman, KS; Maers, KM 2008. „Całkowity węgiel organiczny (TOC) i akwarium rafowe: przegląd wstępny. Część 2." Zaawansowany akwarysta , http://www.advancedaquarist.com/2008/9/aafeature2/
Feldman, KS; Maers, KM 2008. „Całkowity węgiel organiczny (TOC) i akwarium rafowe: przegląd wstępny. Część 1." Zaawansowany akwarysta , http://www.advancedaquarist.com/2008/8/aafeature3/
Feldman, KS; Maers, KM; Vernese, LF; Hubera, EA; Test, MR 2009. „Opracowanie metody do ilościowej oceny wydajności odpieniacza białek”. Zaawansowany Akwarysta . http://www.advancedaquarist.com/2009/1/aafeature2/
Feldman, KS; Maers, KM 2010. Dalsze badania nad wydajnością odpieniacza białkowego.” Zaawansowany Akwarysta . http://www.advancedaquarist.com/2010/1/aafeature
Gaudin, AM; Mulular, AL; O'Connor RF 1960. „Rozdzielanie mikroorganizmów przez flotację. I. Opracowanie i ocena procedur testowych.” Zał. Mikrobiol. 8, 84-90.
Gaudin, AM; Mulular, AL; O'Connor RF 1960. „Rozdzielanie mikroorganizmów przez flotację. II. Flotacja zarodników Bacillus subtilis var. niger ”. Zał. Mikrobiol. 8, 91-97.
Gaudin, AM; Davisa, NS; Bangs, SE 1962. „Flotacja Escherichia coli z chlorkiem sodu”. Biotechnologia. Bioeng. 4, 211-222.
Goldman, JC; Dennett, MR 2000. „Wzrost bakterii morskich w hodowli okresowej i ciągłej w warunkach ograniczenia węgla i azotu”. Limnol. Oceanogr., 45, 789 – 800.
Gottfrieda, M.; Roman, MR 1983. „Połknięcie i włączenie detrytusu koralowego przez zooplankton rafy”. Mar. Biol., 72, 211-218.
Granger, J.; Price, NM 1999. „Znaczenie syderoforów w żywieniu żelazem heterotroficznych bakterii morskich”. Limnol. Oceanogr., 44, 541-555.
Gregori, G.; Citterio, S,; Ghiani, A.; Labra, M.; Sgorbati, S.; Brązowy, S.; Denis, M. 2001. „Rozdzielczość żywych i zaburzonych przez błonę bakterii w wodach słodkowodnych i morskich na podstawie analitycznej cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia kwasem nukleinowym”. Zał. Otaczać. Microbiol., 67, 4662-4670.
Gruber, DF; Simjouw, J.-P.; Seitzinger SP; Taghon, GL, 2006. „Dynamika i charakterystyka ogniotrwałej rozpuszczonej materii organicznej wytwarzanej przez czystą kulturę bakteryjną w eksperymentalnym układzie drapieżnik-ofiara”. Zał. Otaczać. Mikrobiol. 72, 4184-4191.
Hobbiego, JE; Daley, RJ; Jasper, S. 1977. „Zastosowanie filtrów Nucleopore do liczenia bakterii za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Zał. Otaczać. Mikrobiol. 33, 1225-1228.
Johannes, RE 1967. „Ekologia kruszyw organicznych w sąsiedztwie rafy koralowej”. Limnol. Oceanogr., 12, 189-195.
Lebaron, P.; Partuizot, N.; Catala, P. 1998.
„Porównanie niebieskich barwników kwasów nukleinowych do zliczania cytometrycznego bakterii w systemach wodnych”. Zał. Otaczać. Microbiol., 64, 1725-1730.
Kirchman, DL 1994. „Wychwytywanie nieorganicznych składników odżywczych przez bakterie heterotroficzne”. Ekologia mikrobiologiczna, 28, 255-271.
Konhauser, K. 2007. Wprowadzenie do geomikrobiologii. Massachusetts: Wydawnictwo Blackwell.
Kooperman, N.; Ben-Dov, E.; Kramarsky-Winter, E.; Barak Z.; Kushmaro, A. 2007. „Zbiorowiska bakteryjne związane ze śluzem koralowym ze środowisk naturalnych i akwariowych”. FEMS Microbiol Lett, 276, 106-113.
Kvennefors, ECE; Sampayo, E.; Ridgway, T.; Barnes, AC; Hoegh-Guldberg, O. 2010. „Zbiorowiska bakteryjne dwóch wszechobecnych koralowców wielkiej rafy koralowej ujawniają specyfikę zarówno miejscową, jak i gatunkową wspólnych współpracowników bakteryjnych”. PLoS Jeden, 5, e10401.
MacLeod, RA 1965. „Kwestia istnienia określonych bakterii morskich”. Bakteriol. Obj., 29, 9-23.
Marie, D.; Partenski, F.; Jacquet, S.; Vaulot, D. 1997. „Wyliczanie i analiza cyklu komórkowego naturalnych populacji pikoplanktonu morskiego za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwnika kwasu nukleinowego SYBR Green 1.” Zał. Otaczać. Microbiol., 63, 186-193.
Marie, D.; Partenski, F.; Vaulot, D.; Brussaard, C. 1999. „Wyliczanie fitoplanktonu, bakterii i wirusów w próbkach morskich”. Aktualn. Prot. Cytometria, 11.11.11.11.11.15.
Michael, E. 2008. http://glassbox-design.com/2008/achieved-through-observation-and-experimentation/.
Monfort, P.; Baleux, B. 1992. „Porównanie cytometrii przepływowej i mikroskopii epifluorescencyjnej do liczenia bakterii w ekosystemach wodnych”. Cytometria, 13, 188-192.
Monger, BC; Landry, MR 1993. „Analiza cytometrii przepływowej bakterii morskich za pomocą Hoechst 33342”. Zał. Otaczać. Microbiol., 59, 905-911.
Moriarty, DJW; Pollard, PC; Hunt, WG 1985. „Zmienność czasowa i przestrzenna w produkcji bakterii w słupie wody nad rafą koralową”. Mar. Biol., 85, 285-292.
Szlachetny, RT; Fuhrman, JA 1998. Zastosowanie SYBR Green 1 do szybkiego zliczania epifluorescencji wirusów i bakterii morskich.” Wodny. Mikrob. Ek., 14, 113-118.
Paweł JH; Róża, JB; Jiang, SC; Kellogg, Kalifornia; Dickson, L. 1993. „Rozmieszczenie obfitości wirusów w środowisku rafy w Key Largo na Florydzie”. Otaczać. Microbiol., 59, 718-724.
Porter, J. 2004. „Cytometria przepływowa i mikrobiologia środowiskowa”. Aktualn. Protokoły Cytometria, 11.2.1-11.2.13.
Rivkin, RB; Anderson, MR 1997. „Ograniczenie nieorganicznych składników odżywczych w oceanicznym bakterioplanktonie”. Limnol. Oceanogr., 42, 730-740.
Robertson, BR; Button, DK 1989. „Charakteryzowanie bakterii wodnych według populacji, wielkości komórek i pozornej zawartości DNA metodą cytometrii przepływowej”. Cytometria, 10, 70-76.
Rypień, KL; oddział, JR; Azam, F., 2010. „Antagonistyczne interakcje między bakteriami związanymi z koralami”. Środowisko mikrobiologiczne., 12, 28-39.
Suzuki, Y.; Hanagasaki, N.; Furukawa, T.; Yoshida, T. 2008. „Usuwanie bakterii z przybrzeżnej wody morskiej za pomocą separacji piany za pomocą rozproszonych pęcherzyków i substancji powierzchniowo czynnych”. J. Biosci. Bioeng., 105, 383-388.
Thompson, J.; MacLeod, RA 1974. „”Transport potasu i związek między wewnątrzkomórkowym stężeniem potasu a wychwytem aminokwasów przez komórki morskiej pseudomonady”. J. Bacteriology, 120, 598-603.
Todar, K. 2008. Todar's Online Textbook of Bakteriology. http://www.textbookofbacteriology.net/index.html .
Troussellier, M.; Courties, C.; Vaquer, A. 1993. „Ostatnie zastosowania cytometrii przepływowej w ekologii mikroorganizmów wodnych”. Biol. Komórka, 78, 111-121.
Troussellier, M.; Courties, C.; Zettelmaier, S. 1995. „Analiza cytometryczna przepływowa bakterioplanktonu i pikoplanktonu laguny przybrzeżnej: efekty utrwalania i przechowywania”. Ujście. Wybrzeże. Półka Sci., 40, 621-633.
Verschuere, L.; Rombaut, G.; Sorgeloos, P.; Verstraete, W. 2000. „Bakterie probiotyczne jako środki kontroli biologicznej w akwakulturze”. Mikrobiol. Molec. Biol. Obj. 64, 655-671.
Walton, NA; Bjornson, M. 2008. „Dozowanie wódki… destylowane! Potężna metoda redukcji azotanów i fosforanów w akwariach rafowych.” ReefKeeping, 8. http://reefkeeping.com/issues/2008-08/nftt/index.php
Wegley, L.; Mosier-Boss, P.; Lieberman S.; Andrews, J.; Graff-Baker, A.; Rohwer, F. 2006. Środowisko. Microbiol., 8, 1775-1782.
Yoshinaga, I.; Fukami K.; Ishida, Y. 1991. „Porównanie wskaźników syntezy DNA i białek w zgrupowaniach bakterii między wodami rafy koralowej a wodami pelagicznymi w Oceanie tropikalnym”. Morski Ek. Wałówka. Ser., 76, 167-174

Zaloguj się